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反式剪接成熟人ACAT1 mRNA的翻译产物与可选择性起始翻译机制

杨力  
【摘要】:酰基辅酶 A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇 和脂肪酸合成胆固醇酯的酶,在体内胆固醇代谢平衡过程中起到关键的调控 作用。目前,在哺乳动物细胞中发现两种基因编码 ACAT ACAT1 和 ACAT2)。 ( ACAT1 广泛的存在于几乎各种组织细胞中,调控细胞内的胆固醇代谢平衡; 而 ACAT2 则在肝肠细胞中特异性表达,主要参与外源饮食和肝合成的胆固 醇吸收酯化和载脂蛋白的装配。人类一些重要疾病如:高胆固醇血症、引起 冠心病和中风的动脉粥样硬化、以及神经系统的阿尔海默氏疾病、消化系统 的结石病等,都与 ACAT 密切相关。因此,ACAT 已成为分子筛药的重要靶 蛋白。 ACAT 是一种低含量的内质网膜蛋白,早期的研究进展相当缓慢。直到 1993 年,美国 Dartmouth 医学院的 Chang TY 教授实验室首先克隆得到了人 ACAT1 cDNA K1(Chang CCY,et al. 1993),促进了 ACAT 的分子生物学等 研究。我们实验室与 Chang TY 教授实验室合作,在国际上报道了人 ACAT1 的基因组织结构及其启动子序列,发现人 ACAT1 cDNA K1 对应的 4.3 knt mRNA 来源于 1 号和 7 号两条染色体,提示其是通过转录后的特殊反式剪接 成熟,但是其开放阅读框架(open reading frame,ORF)位于 1 号染色体部 分。同时,Chang TY 教授实验室利用 ACAT1 特异抗体 DM10,在人细胞和 cDNA K1 ORF 序列转染的 AC29 细胞(ACAT 活性缺陷的 CHO 细胞株)中, 直接检测到了 50 kDa 人 ACAT1 蛋白的表达。在上述研究的基础上,本论文 1 WP=3 摘 要 工作着重对反式剪接人 ACAT1 mRNA 的翻译及其分子机制进行深入的探索 研究。 首先,将全长ACAT1 cDNA K1转染AC29细胞,再利用ACAT1特异抗体 DM10进行Western blot分析,不仅检测到50 kDa、而且还有56 kDa这两种不溶 性ACAT1蛋白的表达。进而,一系列5'缺失的ACAT1 cDNA K1转染AC29细 胞的研究表明,50 kDa ACAT1蛋白的表达只需要1号染色体来源的ACAT1 cDNA K1序列,而56 kDa ACAT1蛋白的表达则需要两条染色体来源的ACAT1 cDNA K1序列。进一步,利用3'截短了的人ACAT1 cDNA K1序列(1-1786) 进行同样的一系列5'缺失和转染细胞实验,研究结果显示在转染的各种细胞 中均有17和25 kDa两种不同分子量ACAT1 N端产物(ACAT1-NTP)的表达。 其中,17 kDaACAT1-NTP与50 kDaACAT1小蛋白对应,它的表达只需要1号 染色体来源的3'截短型ACAT1 cDNAK1序列;而25 kDaACAT1-NTP与56 kDa ACAT1大蛋白对应,其表达则需要7号和1号两条染色体来源的3'截短型 ACAT1 cDNA K1序列。上述研究直接证实,人ACAT1大蛋白(56/25 kDa) 的表达需要7号和1号两条不同染色体来源的ACAT1 cDNA K1序列,而人 ACAT1小蛋白(50/17 kDa)的表达只需要1号染色体来源的ACAT1 cDNA K1 序列。这些结果也说明,50和56 kDa ACAT1蛋白的大小差异是位于它们的N 端区域。进而,利用特异识别人ACAT1 cDNA K1 ORF起始密码子AUG上游 的同阅读框编码氨基酸序列的一种新制备抗体DM58,结合识别cDNA K1 ORF起始密码子AUG下游编码氨基酸序列的原有ACAT1特异抗体DM10,对 转染表达的ACAT1蛋白进行深入的探索研究。实验结果证实,人50和56 kDa ACAT1蛋白的N端区域引起它们之间的大小差异,是由于ACAT1大蛋白 (56/25 kDa)比ACAT1小蛋白(50/17 kDa)多出一段N端氨基酸序列。进一 步测定这两种不同分子量ACAT1的酶活性结果表明,50 kDaACAT1具有较高 的酶活性,56 kDaACAT1具有较低的酶活性,但均比50和56 kDaACAT1蛋白 2 WP=4 摘 要 共表达的酶活性高,其中50 kDa ACAT1蛋白酶活性比共表达酶的活性高3倍 左右。而免疫双荧光染色和免疫电镜实验研究结果显示,这两种ACAT1蛋白 具有相同的亚细胞定位,即定位于细胞内质网膜。这些表明,50和56 kDa两 种ACAT1蛋白的酶活性存在非常显著差异,而它们共表达的酶活性远远低于 50 kDa ACAT1蛋白酶活性,则提示56 kDa ACAT1蛋白可调控细胞内ACAT1 合成胆固醇酯的活性。最重要的是,利用Western blot和免疫组织化学方法, 在佛波酯(PMA)诱导分化成熟的人单核/巨噬细胞系(THP-1)中检测到了 内源表达的两种ACAT1蛋白,其中56 kDaACAT1蛋白的表达量随着PMA诱导 时间的延长而非常显著增加;同时,人心脏组织和人原代培养的平滑肌细胞 中同样存在内源表达的56 kDaACAT1蛋白。 上述研究首次揭示了反式剪接成熟ACAT1 mRNA在人组织细胞内可翻 译产生一种新的异构体酶(56 kDa ACAT1蛋白),这既是深入研究罕见的人 基因表达通过跨染色体的反式剪接及其机制的重要依据、也为进行反式剪接 成熟mRNA及其可选择性翻译产生两种ACAT1蛋白调控体内组织细胞的胆固 醇代谢功能等探索研究提供了重要线索。进而,本论文工作对选择性翻译产 生的50和56 kDa两种ACAT1蛋白的起始翻译及其相关调控,进行了深入的探 索研究。 人ACAT1 cDNA K1对应mRNA推定的ORF序列位于人1号染色体,该 ORF(1397-3049)5'端存在有两个相近的同框AUG密码子(AUG1397-1399和 AUG1415-1417),而其确切的起始翻译还未有实验研究证据。对这两个AUG作 为翻译起始密码


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