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人IB和X型磷脂酶A2蛋白的去折叠和重折叠

程洪强  
【摘要】:哺乳动物分泌型磷脂酶A2 是一组含有6-8 个二硫键的,分子量为13-16 kDa,水解甘油磷脂的酶。目前发现的这一组蛋白质共有10 种,其中IB 和X 型酶都有前体形式。本论文以人的IB 和X 型磷脂酶A2 为研究对象,研究了蛋白质的去折叠和重折叠反应。 人IB 型磷脂酶A2 和其前体蛋白在大肠杆菌中皆以包涵体的形式表达。包涵体经重折叠后纯化得到均一的蛋白质。用圆二色,荧光和反相HPLC 的方法研究了人IB 型磷脂酶A2 和前体蛋白在盐酸胍和DTT 作用下的去折叠行为。结果表明,由于前体蛋白在N-端比成熟蛋白多了一段前体肽,其稳定性降低了。前体蛋白的这一亚稳态结构直接导致了去折叠后的前体蛋白更容易恢复原来的结构,前体蛋白的重折叠效率比成熟蛋白提高约50 %。改善折叠的前体肽没有氨基酸组成的要求,但是需要一定的肽长度。在人IB 型磷脂酶A2 的所有二硫键中,11-77 二硫键暴露在分子的表面,最先被还原。 人X型磷脂酶A2 和人IB 型酶在氨基酸序列和三级结构上都具有较高的同源性。在我们的实验中,用于IB 型酶的稀释重折叠方法对X 型酶无效,主要原因是X 型酶在重折叠过程中形成了分子间的二硫键。低温,低蛋白质浓度和高pH 值可以提高人X 型磷脂酶A2 的重折叠效率。L-精氨酸能够提高人X 型磷脂酶A2 包涵体的重折叠效率。进一步的比较研究表明,L-精氨酸的这一功能与其特殊的分子结构有关。L-精氨酸帮助人X 型磷脂酶A2 的重折叠,表现为阻止了分子间二硫键的生成和重折叠之初的蛋白质积聚。 另外,我们利用DsbA 蛋白被金属硫蛋白还原后荧光增强的特性建立了金属硫蛋白的定量测定方法。


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