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福寿螺(Ampullaria crossean)内切-β-1,4葡聚糖酶的研究

李燕红  
【摘要】:纤维素是自然界最为丰富的可再生资源,它是由葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接成的聚合物。自1998年以来,相继在线虫、白蚁、鳌虾、鲍鱼、甲虫等体内发现了内切-β-1,4-葡聚糖酶的cDNA。这些发现一方面使动物自身不分泌纤维素酶的传统观点受到了挑战,另一方面为寻找新的纤维素酶资源开辟了新的领域。本文从草食性软体动物福寿螺的胃液中分离纯化到了三种内切-β-1,4-葡聚糖酶,分别命名为EG65,EG45和EG27,并较为详细地研究了它们的性质,其中EG65和EG45为糖蛋白。 在此基础上,以EG65N-末端序列和鲍鱼、鳌虾内切-β-1,4-葡聚糖酶的保守氨基酸序列为前提,从福寿螺胃组织cDNA文库中克隆到了3组与EG65同源的8个内切-β-1,4-葡聚糖酶的cDNAs,即eg65-a(包括1条cDNA),eg65-b和eg65-c(分别包括3、4条氨基酸序列同源性高达98%以上的cDNAs),分别编码713,723和722个氨基酸残基,均属于糖苷水解酶第九家族,并含有一个第Ⅱ家族的纤维素结合结构域以及N-端16-18个氨基酸残基组成的信号肽。 在甲醇酵母GS115中分别表达了eg65-al,eg65-b1和eg65-c1去信号肽序列且N-末端附加His-Tag的EG65-a-16,EG65-b-16,EG65-c-16以及去信号肽和纤维素结合结构域序列且N-末端附加His-Tag的EG65-a-137,EG65-b-148和EG65-c-147等6种重组酶。这6种重组酶均有特异的水解CMC-Na的活性,但是它们水解CMC-Na的能力不同。另外从福寿螺卵巢基因组DNA中克隆到了eg65-c1包括4个内含子和5个外显子的部分基因组序列(1597 bp),进一步确定了福寿螺自身可以分泌内切-β-1,4-葡聚糖酶。 本文还发现SDS-PAGE均一的EG65,其双向凝胶电泳图谱呈现为分子量相似而等电点不同的一串念珠式的蛋白质点,这些蛋白质点有相似的多肽质量指纹图谱,克隆到的3组与EG65同源的8个基因编码的相当于组织酶的氨基酸序列的同源性达85%以上,它们的分子量相近,且略小于组织酶EG65的分子量;理论等电点从pH5.6到6.4不等,与组织酶EG65的双向凝胶电泳所显示的等电点基本一致。另外,组织酶EG65是糖蛋白,而且福寿螺自身又存在多种翻译后修饰系统。因此造成福寿螺内切-β-1,4-葡聚糖酶EG65蛋白质多态性的原因可能是氨基酸序列的微观不同以及不同的翻译后修饰。 此外,本文还从福寿螺的胃液中分离并鉴定出了一种新的纤维素酶产生菌种


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