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大鼠附睾beta-defensins的表达方法和抗菌活性研究及猴附睾特异表达基因RNase 9的表达和功能探索

刁华  
【摘要】: β-defensins是重要的天然免疫分子,构成了生物体与外界环境的之间的保护屏障。最近的研究发现,β-defensins不仅参与抗微生物天然免疫、抗病毒、趋化和免疫增强作用,还在细胞分化、肿瘤发展、组织重构等过程中发挥广泛的功能。Bin1b是大鼠附睾特异表达的β-defensin,过去的研究表明Bin1b具有抗菌功能,参与起始精子运动。迄今在大鼠、小鼠和人类分别发现了43,52和39个β-defensin,多数主要在雄性生殖系统成簇表达,而且在附睾中的表达具有区段特异性。为了了解以Bin1b为代表的β-defensins的生理功能以及为抗菌肽的开发打好基础,本课题从β-defensins的基因重组表达研究入手,试图探索β-defensins的表达方法,为几十个未知功能的β-defensins研究提供重组多肽。以Bin1b为表达对象,我们进行了体外无细胞系统、毕赤酵母、昆虫细胞、大肠杆菌系统和小球藻系统等的摸索表达,在内含肽(intein)为基础的表达系统IMPACT-TWIN中得到了较好的表达。作为对照,同时表达了大鼠非附睾特异表达的RBD1,人类非附睾表达的HBD2。这三个多肽都得到了活性表达,而且都对大肠杆菌和致病性白色念珠菌具有抗菌活力。其中RBD1的重组表达和抗菌活性研究是第一次报道。此外,RBD1和rBin1b还对HIV1感染具有抑制作用。这些表达研究探索为大量的附睾特异和非特异表达的β-defensins结构和生理功能研究打下了一定的基础。 我们还对功能未知的猴附睾特异表达基因ESC461(RNase9)进行了重组表达研究。分别尝试了毕赤酵母,昆虫细胞,大肠杆菌等表达系统,在大肠杆菌系统中得到了较大量的包涵体表达。通过摸索复性条件,发现ESC461(RNase9)适合进行稀释复性,而且在较高浓度的盐溶液中比较稳定。重组蛋白没有测出核糖核酸酶的活性,但是表现出了抗菌活性。同RNaseA家族成员一样,ESC461(RNase9)具有相似的肝素结合能力。由于ESC461(RNase9)等电点较低,与RNases家族抗菌活性的机理似乎矛盾,本文认为肝素结合多肽的抗菌机理可能是更恰当的解释。通过对肝素结合多肽的功能分析,我们可以从更加广阔的视野来检视RNase9可能具有的生理功能。对ESC461(RNase9)的成熟肽序列的ScanProsite扫描分析表明,存在一些可能的结构域和基序。上述综合信息将对ESC461(RNase9)的功能探索具有指导作用。


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1 刁华;大鼠附睾beta-defensins的表达方法和抗菌活性研究及猴附睾特异表达基因RNase 9的表达和功能探索[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2007年
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