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D-氨甲酰水解酶可溶性表达的遗传改造和结构与功能研究

姜世民  
【摘要】: 大肠杆菌重组表达系统的主要问题之一,是过量表达的目的蛋白常常以不可溶的形式存在,因而不具有生物学活性。这影响了许多蛋白的性质研究和工业应用,因此需要建立新型有效的改造方法。本论文以重要工业用酶D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase, DCase)为研究对象,通过共表达和基因改造技术提高其在大肠杆菌中的可溶性表达,并对突变体进行结构与功能研究。D-氨甲酰水解酶是β-内酰胺类抗生素中间体D-对羟基苯甘氨酸制备的关键酶。我们克隆了一个来源于皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)的D-氨甲酰水解酶,但在大肠杆菌过量表达后,80%左右目的蛋白以包涵体的形式存在,所以基因工程菌的酶活力比较低,成为工业应用瓶颈。 为提高D-氨甲酰水解酶在大肠杆菌中的可溶性表达,首先采用了分子伴侣共表达技术。将三种分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE(DnaKJE)、GroEL-GroES(GroELS)和trigger factor(TF)分别与D-氨甲酰水解酶共表达。结果显示,在分子伴侣GroESL的辅助下,D-氨甲酰水解酶在大肠杆菌表达系统中的可溶性明显增加,相比于野生型,酶活提高了3倍。然而在实际应用中会涉及分子伴侣诱导物可使用性问题,因此我们又尝试了基因定向进化的方法。 定向进化技术是在实验室里模拟自然进化的过程,通过对编码蛋白质的基因进行随机突变,从而定向筛选出特定突变体的有效方法。我们首先使用易错PCR和DNA Shuffling操作,对DCase基因进行随机突变,再通过一种蛋白质可溶性结构互补监测系统将正突变检出,筛选获得了一系列可溶性表达增加的突变体。通过详细分析这些突变体的氨基酸序列,并结合定点突变鉴定这些突变位点,揭示了与DCase的可溶性表达密切相关的三个重要氨基酸残基A~(18)、Y~(30)和K~(34)。同源四聚体和单体的结构模建结果显示,A~(18)位于β-折叠片和α-螺旋之间的一个转角上,而Y~(30)和K~(34)位于同一个α-螺旋,且三个突变点都位于蛋白分子的表面,远离蛋白的催化和活性中心。进一步的定点替换突变分析表明,这三个氨基酸残基的电荷改变和(或)亲水性的变化是D-氨甲酰水解酶突变体在E. coli中可溶性表达增加的两个关键因素。突变酶A18T和Y30N可溶性的增加主要由于突变位点氨基酸残基亲水性的提高;而K34E突变酶可溶性的提高可能主要归功于蛋白负电荷的增加。在此基础上,又对这三个位点进行了组合突变。SDS-PAGE结果表明,其中一个命名为DCase-M3的三联突变体(A18T/Y30N/K34E)在E. coli过量表达时,80%以上的目的蛋白成为可溶状态,很好地体现了有效突变的叠加作用。此外,对纯化的野生型DCase和突变型DCase-M3进行了酶学性质测定和对比,二者在动力学常数、热力学稳定性、最适温度、最适pH以及热稳定性等方面相似,可见在突变提高可溶性表达的同时并没有改变D-氨甲酰水解酶原有的特性。 在上述研究的基础上,为了进一步弄清所获得的可溶性显著提高的D-氨甲酰水解酶突变体在工业发酵中应用的可行性,我们进行了D-氨甲酰水解酶改造前后发酵活力的比较实验。首先对野生型D-氨甲酰水解酶和单点突变D-氨甲酰水解酶K34E进行多种组合的摇瓶发酵实验,包括使用三种不同的培养基(LB、TB和改良的工业培养基)和三种不同的诱导温度(22℃、30℃和37℃)。结果显示,在所使用的培养条件下,单点突变D-氨甲酰水解酶K34E的酶活都不同程度地优于野生型。同时我们综合考虑D-对羟基苯甘氨酸制备的两个关键酶:D-乙内酰脲酶(DHase)和D-氨甲酰水解酶(DCase),通过引入突变DCas(eK34E),串联构建了一菌两酶的大肠杆菌基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pCHWT(DHase/ DCase)和E.coli BL21(DE3)/pCHMU(DHase/ K34E)。发酵结果显示,突变工程菌E. coli BL21(DE3)/pCHMU表现出的DHase/DCase的综合催化效率明显高于E. coli BL21(DE3)/pCHWT,提高近一倍。此外,我们还对高可溶性表达的三突变酶DCase-M3进行了5升发酵罐发酵研究,结果说明,在放大发酵培养的条件下,突变酶DCase-M3与野生型DCase相比活力提高了近7倍,表现出很大的工业应用潜力。


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