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镁黄长石与Slit2对骨髓基质干细胞成骨分化的影响

孙红立  
【摘要】: [目的] 1.前期的研究表明,镁黄长石生物活性陶瓷(akermanite),具有良好的生物力学性能,并且在模拟体液中形成骨样羟磷灰石,能够明显促进大鼠成骨细胞的增殖。但并不知道,akermanite对于更具有临床意义的人骨髓基质干细胞(hBMSC),是否也具有良好的生物活性,对于其增殖和成骨分化有何影响,因此我们研究的第一项目的是通过体外研究回答这一问题。 2.不同生物陶瓷材料表现出对hBMSC增殖和成骨分化的不同影响,第二项研究目的是研究不同生物陶瓷产生不同生物活性的原因,包括akermanite和β-TCP的材料浸提液对hBMSC增殖和成骨分化的影响;浸提液中不同离子对间充质干细胞系C3H10T1/2的成骨分化能力的影响,探讨生物陶瓷影响细胞分化的机制。 3.体外细胞分子水平生物活性评价,有利于从机理上分析材料的生物学性能,但对于生物材料整体的评价还有赖于动物体内的实验评价,因此我们第三项研究目的是,通过动物体内实验观察其生物相容性、骨整合和骨长入能力。 4.在体内,成骨细胞及其前体细胞—间充质干细胞的成骨分化受到多种因素的调控,到目前为止没有关于神经导向分子—Slit/Robo在成骨类细胞中的表达和作用的报道,我们第四项的研究目的是研究Slit/Robo在成骨类细胞中的表达及对成骨分化的影响。 5.生长因子尤其是其受体若在成骨类细胞中表达,肯定行使某种生理功能,我们第五项研究的目的是观察Slit/Robo对成骨类细胞成骨分化的作用,以及可能的作用途径。 [方法] 1.从人的骨髓中分离hBMSC,分别进行成骨和成脂方向诱导以验证其多向分化的能力;并且比较不同代数细胞的增殖能力,验证其扩增能力;利用SEM检验hBMSC是否能在akermanite和β-TCP的材料良好的黏附生长;利用Alamar Blue和乳酸代谢的方法比较hBMSC在两种材料表面的增殖和代谢情况;利用ALP染色和pNPP的方法比较hBMSC在两种材料表面的ALP活性;利用RT-PCR方法比较hBMSC在两种材料表面的成骨分化标志基因ALP,OPN,BSP和OCN的表达。 2.利用MTT方法比较hBMSC在两种材料浸提液中的增殖能力;利用pNPP的方法比较hBMSC在两种材料浸提液中的ALP活性;利用RT-PCR和Real Time-PCR方法比较hBMSC在两种材料浸提液中的成骨分化标志基因ALP,OPN,BSP和OCN的表达;检验Mg~(2+)不同浓度对C3H10T1/2成骨分化的影响。 3.将多孔的akermanite材料植入新西兰大白兔的股骨髁,在4周和12周分别取材,进行硬组织切片和品红-苦味酸染色,评价分析材料在体内的骨整合性和骨长入能力。 4.分别分离纯化大鼠颅骨成骨细胞(Rat-OB)和大鼠骨髓基质干细胞(Rat-BMSCs)并验证其成骨分化能力;诱导C3H10T1/2和MC3T3-E1小鼠细胞系成骨分化;分别提取Rat-OB,Rat-BMSCs,C3H10T1/2和MC3T3-E1的mRNA,利用RT-PCR鉴定slit2,Robo1, Robo2, Robo3和Robo4的表达;利用Western blots鉴定Robo1和Robo2的表达。 5.我们利用稳定表达Slit2重组蛋白的细胞株slit2-myc/HEK293获取含有Slit2蛋白的条件培养液,研究Slit2对Rat-OB/ MC3T3-E1的成骨分化的影响,并研究该作用是否是剂量依赖;我们将能够表达HA-RoboN重组蛋白的表达质粒RoboN /pCS~(2+),利用磷酸钙沉淀的方法转染到HEK293细胞中,质粒RoboN /pCS~(2+)在转染后36h分泌表达RoboN,该蛋白作为Slit2的受体能够特异性地与Slit2结合,但因为只有胞外端,所以能够竞争性的拮抗Slit2对细胞的作用,以此来研究Slit2对成骨分化的作用是否是通过与其受体Robo结合介导的;通过对RhoA/ROCK信号通路被其激动剂LPA激活或被拮抗剂Y27632抑制来研究Slit/Robo对成骨分化的作用是否依赖于RhoA/ROCK信号通路。 [结果] 1. SEM的观察证明,hBMSC能够在材料表面有效的黏附生长。Alamar Blue和乳酸代谢测定的结果,说明akermanite与β–TCP相比更有利于细胞的增殖和代谢。碱性磷酸定量测定的结果说明,在相同条件下akermanite能更有效的提高hBMSC的碱性磷酸酶的表达,这种促进作用即使在非诱导条件下也非常显著(p0.05)。从半定量的RT-PCR结果中可以看出,akermanite可以明显地提高提高包括ALP,OPN,BSP和OCN成骨标志基因的表达。 2. MTT的结果显示,在较低的浓度范围内,akermanite的浸提液确实显示出比β–TCP更强的促进hBMSC增殖的能力,但在高浓度范围内,却没有β-TCP的促进能力强。诱导成骨分化培养液中添加了低浓度的材料浸提液后,akermanite浸提液确实在一定程度上增加了ALP活性,Real Time PCR的结果也说明akermanite浸提液能够促进成骨标志基因的表达。Mg2+的添加确实能够提高间充质干细胞C3H10T1/2的ALP活性并且有剂量依赖性。 3.在兔子体内植入材料后, 4周和12周硬组织切片证明,该材料具备良好的生物相容性,骨整合能力和骨长入能力。 4. RT-PCR的结果发现,Slit2, Robo1, Robo2 ,在Rat-OB和MC3T3-E1基本成组成性表达; Rat-MSC, C3H10T1/2细胞只有向成骨细胞分化后才有表达;Robo3和Robo4在所有细胞中没有检测到表达;但我们利用Western blots的方法却没有检测到在Rat-OB中有表达。 5.当我们向培养液中加入Slit2蛋白后,结果显示,Rat-OB和MC3T3-E1的成骨分化基本被抑制,而且具有剂量依赖性。这个结果提示,Robo1或Robo2很可能在成骨细胞上存在,并且Slit2对成骨分化有显著的调控作用。将含有RoboN的培养液加入Slit2条件培养液后,结果证明确实阻断了Slit2对Rat-OB成骨分化的抑制作用,这说明Slit2对成骨分化的抑制作用是同过与其受体结合介导的。因为我们的研究发现,RhoA/ROCK信号通路被其激动剂LPA激活或被拮抗剂Y27632抑制后,并不影响Slit2对成骨分化的抑制作用,所以Slit/Robo对成骨分化的抑制作用不是主要通过RhoA/ROCK信号通路实现的。 [结论] 1. hBMSC在两种生物活性陶瓷表面上生长时,Akermanite与β-TCP相比,能够促进hBMSC的增殖及其向成骨分化,这种促进成骨分化的作用不仅在成骨诱导条件下,在非诱导条件下也能明显的促进成骨分化。 2. Akermanite材料浸提液在一定的浓度范围内与β-TCP的浸提液能够促进hBMSC的增殖及其向成骨分化;离子成分的差异是造成材料生物活性差异的重要原因。 3. Akermanite植入兔子体内后表现出良好的生物相容性,骨整合能力和骨长入能力,Akermanite可能是一种在骨修复、再生和组织工程中很有前途的生物活性材料。 4.我们首先发现了神经导向分子Slit/Robo通路的mRNA在多种成骨细胞中表达。 5. Slit2对于成骨细胞分化有强烈的抑制作用,具有剂量依赖性,并通过与细胞表面的受体结合介导Slit2对于成骨细胞分化的抑制作用,但不依赖于RhoA/ROCK信号通路,这些发现说明Slit/Robo很可能在骨组织发育中有重要作用,也有可能成为治疗骨科疾病潜在的药物靶标。


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