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人阴离子交换蛋白1(带3蛋白)C端域结构与功能的研究

王勇  
【摘要】: 人阴离子交换蛋白1 (Anion Exchanger 1, AE1)是红细胞膜上含量最丰富的蛋白质,主要介导Cl-和HCO3-的跨膜交换。AE1 C-端域由40个氨基酸残基组成,其在AE1阴离子交换和转膜过程中所起的作用还不清楚。为研究该结构域不同的氨基酸序列的功能,本研究构建了四个AE1突变表达载体,分别在AE1C-端域删除了以下氨基酸序列:Ala891-Phe895、Asp896-Glu899、Asp902-Glu906和Val907-Val911。将这些突变表达载体在HEK 293细胞中进行表达,Western blotting结果显示,删除Ala891-Phe895、Asp896-Glu899和Val907-Val911使AE1表达升高,而删除Asp902-Glu906则使其表达降低。Pulse chase assay分析表明突变体表达水平的不同并非由蛋白质稳定性改变所引起。细胞表面生物素酰基化试验发现Ala891-Phe895、Asp902-Glu906和Val907-Val911氨基酸序列的缺失使AE1转膜水平降低,而删除Asp896-Glu899则加快了AE1的转膜过程。所有的突变体其阴离子交换活性均下降,说明删除的氨基酸序列在AE1阴离子交换过程中均发挥重要作用。为进一步研究AE1 C-端域的结构与功能,我们用AE1 C-末端112个氨基酸序列为饵筛选了K562细胞cDNA文库。阳性克隆质粒经过鉴定为肿瘤抑制基因p16,AE1和p16的相互作用在酵母和哺乳动物细胞中得到了进一步验证。功能研究表明,在HEK 293t细胞中,p16促进AE1向膜转运,同时促进其阴离子交换活性,AE1上调内源性p16的表达。我们的发现揭示了AE1和p16的新生物学功能。


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