光系统Ⅱ反应中心细胞色素b559结构和功能的研究

【摘要】： 植物已经演化出多种保护其免受强光抑制和破坏的机制，从而使植物体在 自然界能够应付复杂多变的光照环境。虽然人们早就确定Cyt b-559存在于PSII 反应中心内，但目前对其性质与功能的认识还不充分。本工作的目的就是研究 Cyt b-559天然分子特性，探讨其生理功能和存在的意义。取得了一些有新意的 结果： 1、依据PSII反应中心分离纯化的原理，应用更有效的层析介质DEAE- Sephacel，我们设计了快速高效的从菠菜和水稻中分离纯化Cyt b-559的方法和 流程，获得了高纯度的样品。它们在非变性胶电泳中具有相同的泳动性。蛋白 组分的HPLC结果证明，纯化的Cyt b-559的确由两个亚基组成，α亚基和β亚 基的分子量用我们设计的适合于分析小蛋白的Tricine—SDS—PAGE方法准确 测定为9.4kDa和4.5kDa。 2、利用HPLC技术分析了纯化的Cyt b-559样品的色素组成，结果表明Cyt b-559中含有Chl α而不含类胡萝卜素分子，这一结果通过吸收光谱和共振拉曼 光谱的分析得到进一步地证明。通过等电聚焦方法分析了Cyt b-559的等电点， 发现其亚基的等电点相差很大，全蛋白的等电点与D1、D2蛋白的等电点也不 相同，推测在体内生理pH条件下它们具有相反带电性而在PSII组装中发挥作 用。 3、低温荧光光谱的检测结果表明，Cyt b-559的荧光发射峰位在563nm和 666nm；首次证明Cyt b-559可以发出荧光和将电子传递给结合在其上的辅助叶 绿素，但传递能力比较低故而导致其荧光特性与PSII反应中心的不相同。Cyt b-559的紫外荧光光谱表明Trp残基位于其内部的疏水区域，证明Cyt b-559中 的芳香族氨基酸可能在其功能的发挥中起一定作用。 4、通过MCD的分析，发现Cyt b-559中血红素的MCD信号在540—580nm 和400—440nm波段，而且光谱形状和强度与PSII反应中心的相一致，说明PSII 反应中心该范围内的MCD信号中有Cyt b-559的贡献。FTIR光谱的测定结果 证明Cyt b-559血红素的配体是组氨酸，其二级结构中α-螺旋占了一半。此外， 还比较了Cyt b-559和PSII反应中心的膜脂成分，发现两者有很大的相似性。 不同植物来源的Cyt b-559在许多性质上都表现出高度一致，从一个侧面证明Cyt b巧59在进化中的保守性。 5、PSll反应中心发生光破坏时，原初电子供体P680己受到严重破坏。我 们发现，在光抑制的最初一段时间内，Cyt H559吸收峰值发生变化：在受体 侧光抑制的条件下，其吸收峰值先略有增加而后才下降，而在供体侧光抑制条 件下则相反，说明 Cyt b巧59对光抑制的发生非常敏感，可能在光抑制早期保护 PSll反应中心。 6、纯化的Cyt H559的组氨酸含量在照光前后没有显著的变化，说明 PSll 反应中心内被破坏的组氨酸不属于Cyt H559。PSll反应中心所含的组氨酸中 有些可被DEPC修饰，但我们的实验结果表明DEPC不能修饰Cyt H559的组 氨酸。这可能有利于Cyt ie559保护功能的发挥。 7、我们观察到，在两种光抑制条件下，LP Cyt b659光还原和 HP Cyt s559 光氧化具有对pH值的依赖性，说明Cyt b659在光保护中的作用不仅与其高低 电势态有关，而且与其质子化程度有联系。CCCP促进HP Cyt b659释放质子， 从而维持循环电子传递。DCBQ和 DCMU在很低浓度时都抑制 Cyt b659光还 原，前者不影响Cyt b659光氧化而后者在CCCP存在时也会抑制Cyt b659光 氧化。 8、Cyt bl59有定位PSll反应中心其它蛋白的锚蛋白的作用。黄化苗转绿 实验证明在 HP Cyt b659的含量增加超过 45％以后放氧活性开始逐渐增加。Cyt b－559从低电势态到高电势态的转变是放氧复合物组装到PSll反应中心的关键 步骤之一。在植物正常生长时，Cyt b559与 P680的其它电于供体发生竟争， 起到安全阀门的作用。 9、在逆境条件下，Cyt b上59具有保护PSll反应中心免受强光破坏而起到 “分于开关”的作用。我们的实验表明，在室温条件下存在通过Cyt b659的环 式电子流，存在从氧化态LP Cyt b559到还原态HP Cyt b乃59的一个循环，其 中的氧化还原变化与质子化／去质子化反应相连。通过与其它血红素蛋白的比 较，我们推测 Cyt b巧59“分子开关”的关键是：光抑制情况下，铁原子与远 端His之间的疏水空穴被氧自由基占据后使得铁进入叶琳中央孔中，迫使近端 HIS向叶琳平面位移，从而引起 Cyt b巧59构象改变，使电势态发生转变。