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水稻、菠菜紫黄质脱环氧化酶基因的克隆、遗传转化及其特性的研究

林荣呈  
【摘要】: 自发现叶黄素循环具有热耗散的作用后,它被引起广泛的关注。目前普遍认为叶黄素循环的色素定位于天线色素蛋白复合体上,在跨膜质子梯度(△pH)形成后,玉米黄质(Z)和环氧玉米黄质(A)能够从叶绿素中吸收过多的激发能,并以热能的形式耗散到体外,从而保护光合器官免受强光的破坏。紫黄质脱环氧化酶(VDE)是叶黄素循环的关键酶,在较低的pH条件下,它能在数分钟内将紫黄质(V)转变为Z和A。本论文从水稻和菠菜中克隆了编码VDE酶的基因,并通过转基因植物进一步研究了叶黄素循环在热耗散方面的作用,主要获得了以下结果: 首次从两个水稻亚种(籼稻和粳稻)中克隆了Rvde基因(分别命名为iRvde和jRvde)的全长cDNA序列,分别长1647bp和1887bp,两者开放阅读框的同源性为98%,与其它已知vde基因的同源性在60%以上。推导两者均编码446个氨基酸,其中转运肽序列长98个氨基酸,两者成熟蛋白的氨基酸序列完全相同,与已知VDE成熟蛋白的同源性在75%以上,其中与小麦的同源性最高,达87.4%。 通过PCR扩增获得了Rvde基因的核基因组DNA序列,在它们的编码区中含有4个内含子,其长度在jRvde中分别为105bp、327bp、81bp和69bp,而iRvde基因的第2个内含子长425bp,与jRvde的第2个内含子差别较大。内含子的AT含量为60~63%,其两端为典型的GT/AG结构。 构建了jRvde基因的原核表达载体pET-Rvde,在0.4mmol/L IPTG的诱导下,该基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达,SDS-PAGE和Western杂交表明表达蛋白的分子量约为43kDa。随着IPTG诱导时间的延长,蛋白量逐渐增加,诱导4h后,它占大肠杆菌总蛋白的25%左右。吸收光谱差值A_(502-540)随反应的进行逐渐增大,反应体系总色素的HPLC分析表明,V逐渐降低,而Z刚好相反,说明表达的蛋白具有与活体VDE酶相同的功能,能在体外将V转变为A和Z。 从菠菜中克隆了Svde基因,并构建了该基因的反义抑制植物表达载体pCB-antiSvde,用根癌农杆菌介导法转化烟草,获得了大量的转基因植株。再生的愈伤组织经GUS染色后呈兰色。PCR扩增潮霉素抗性基因hpt和Svde基因结果显示,在 ‘转淬回植株T斤T;代中都分别扩增出互.okb和二.4比的目的片段,而在未转化的对照 植株中没有扩增。转基因植株的L代种了在潮霉素培养基上的萌发数与未萌发数的 比值为3:l,符合单基因的盂德尔分离规律。从T;代转基因植株中筛选出抑制程度较 强的一个株系A29,Soul。hem杂交结果表明外源S。de因已整合到烟草的基因组中, 并且只有一个插入位点。通过冻融法从该植株的类囊体中提取VDE酶,其酶活性为 3.2,是对照植株的45.7%,表明VDE酶受到了抑制。荧光动力学及HPLC测定结果显 示,强光处理后,在转基因植株中,Z和A的形成较少,非光化学淬灭(NPQ)值较对 照低,Fv”m的下降较对照快,表明转基因植株的热耗散能力下降,进而说明叶黄素 循环具有热耗散的功能。 同时还建立了根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系,并初步作了转化sVs基因 的试验。另外,还建立了一种适合于筛选转基因植株的DNA微量提取法,此方法操 作快捷方便,一个人在一天内能制备 50多个样品,100mg的植物鲜样平均可获得 40卜g的DNA,提取的DNA可直接用于PCR反应、酶切分析及Southern分析。


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