水稻、菠菜紫黄质脱环氧化酶基因的克隆、遗传转化及其特性的研究

【摘要】： 自发现叶黄素循环具有热耗散的作用后，它被引起广泛的关注。目前普遍认为叶黄素循环的色素定位于天线色素蛋白复合体上，在跨膜质子梯度(△pH)形成后，玉米黄质(Z)和环氧玉米黄质(A)能够从叶绿素中吸收过多的激发能，并以热能的形式耗散到体外，从而保护光合器官免受强光的破坏。紫黄质脱环氧化酶(VDE)是叶黄素循环的关键酶，在较低的pH条件下，它能在数分钟内将紫黄质(V)转变为Z和A。本论文从水稻和菠菜中克隆了编码VDE酶的基因，并通过转基因植物进一步研究了叶黄素循环在热耗散方面的作用，主要获得了以下结果： 首次从两个水稻亚种(籼稻和粳稻)中克隆了Rvde基因(分别命名为iRvde和jRvde)的全长cDNA序列，分别长1647bp和1887bp，两者开放阅读框的同源性为98％，与其它已知vde基因的同源性在60％以上。推导两者均编码446个氨基酸，其中转运肽序列长98个氨基酸，两者成熟蛋白的氨基酸序列完全相同，与已知VDE成熟蛋白的同源性在75％以上，其中与小麦的同源性最高，达87.4％。 通过PCR扩增获得了Rvde基因的核基因组DNA序列，在它们的编码区中含有4个内含子，其长度在jRvde中分别为105bp、327bp、81bp和69bp，而iRvde基因的第2个内含子长425bp，与jRvde的第2个内含子差别较大。内含子的AT含量为60～63％，其两端为典型的GT／AG结构。 构建了jRvde基因的原核表达载体pET-Rvde，在0.4mmol／L IPTG的诱导下，该基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达，SDS-PAGE和Western杂交表明表达蛋白的分子量约为43kDa。随着IPTG诱导时间的延长，蛋白量逐渐增加，诱导4h后，它占大肠杆菌总蛋白的25％左右。吸收光谱差值A_(502-540)随反应的进行逐渐增大，反应体系总色素的HPLC分析表明，V逐渐降低，而Z刚好相反，说明表达的蛋白具有与活体VDE酶相同的功能，能在体外将V转变为A和Z。 从菠菜中克隆了Svde基因，并构建了该基因的反义抑制植物表达载体pCB-antiSvde，用根癌农杆菌介导法转化烟草，获得了大量的转基因植株。再生的愈伤组织经GUS染色后呈兰色。PCR扩增潮霉素抗性基因hpt和Svde基因结果显示，在 ‘转淬回植株T斤T；代中都分别扩增出互．okb和二．4比的目的片段，而在未转化的对照 植株中没有扩增。转基因植株的L代种了在潮霉素培养基上的萌发数与未萌发数的 比值为3：l，符合单基因的盂德尔分离规律。从T；代转基因植株中筛选出抑制程度较 强的一个株系A29，Soul。hem杂交结果表明外源S。de因已整合到烟草的基因组中， 并且只有一个插入位点。通过冻融法从该植株的类囊体中提取VDE酶，其酶活性为 3．2，是对照植株的45．7％，表明VDE酶受到了抑制。荧光动力学及HPLC测定结果显 示，强光处理后，在转基因植株中，Z和A的形成较少，非光化学淬灭（NPQ）值较对 照低，Fv”m的下降较对照快，表明转基因植株的热耗散能力下降，进而说明叶黄素 循环具有热耗散的功能。 同时还建立了根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系，并初步作了转化sVs基因 的试验。另外，还建立了一种适合于筛选转基因植株的DNA微量提取法，此方法操 作快捷方便，一个人在一天内能制备 50多个样品，100mg的植物鲜样平均可获得 40卜g的DNA，提取的DNA可直接用于PCR反应、酶切分析及Southern分析。