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小麦春化相关基因元件克隆分析与小麦矮化突变体的研究

徐文忠  
【摘要】:一、春化相关基因全长cDNA序列及其启动子的克隆与分析研究 通过建立小麦(Triticum aestivum.L.cv Jingdong No.1) 胚芽春化cDNA文 库,以春化相关基因VER2的3’端序列为探针,筛选获得全长1195 bp cDNA 序列,它编码300个氨基酸。在VER2中存在植物疾病抗性反应蛋白和茉莉酸 诱导凝集素两种蛋白的结构域。另外在VER2蛋白中存在核定位信号和多种磷 酸酶的作用位点,VER2可能参与了多种调控途径。 以VER2基因的cDNA为探针,利用改进的池式PCR以及高密度膜杂交筛 选的方法,从小麦TAC基因组文库中获得41,788 bp的基因组克隆,该序列含 有11个基因,其中VER2基因位于第三个基因。VER2基因组序列含有3个内 含子,4个外显子与cDNA序列100%同源。通过对转录起始点和转录终止点的 分析,进一步证明从cDNA文库筛选得到的VER2基因为全长序列。 对VER2基因的上游启动子区域进行分析,发现基因上游启动子区存在三 个小的重复序列,每个片段有482 bp,另有两个较大的重复序列,每个片段有 2,161 bp。对上游2. 8 kb启动子区(不含重复序列)的响应元件分析,其包括ABA 响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(Me-JARE)、胚乳特异性表达元件、 参与淀粉酶合成的元件以及存在类似GA响应元件(ATAACAAAC)如 ATAACATAC等等。根据VER2基因上游6 kb序列结构特点,将VER2启动子 区域进行缺失突变形成10个片段,分别以GUS和GFP为报告基因构建成瞬间 表达载体和植物表达载体等四类质粒。通过基因枪方法将最大片段(6 kb)驱 动GFP报告基因的瞬间表达载体转入经春化处理或未春化处理的小麦幼叶中, 结果发现GFP在春化处理的幼叶中表达,而在未春化处理的幼叶中不表达,说 明VER2基因的启动子驱动基因转录受春化处理调控。 二、小麦矮化突变体的研究 通过对小麦矮化突变体gaid遗传生理分析发现该突变体为半显性阻断GA 信号途径,由此发现在赤霉素信号途径中,α-淀粉酶的诱导一定程度上通过某 些与株高相关的基因控制。突变体gaid呈现对高浓度的脱落酸更敏感,当ABA 浓度达到10一恤时,突变体的生长几乎完全受到了抑制,而野生型的生长需要 ABA浓度达到10一SM时才能完全受到抑制。通过突变体gaid对乙烯等抑制型生 长调节剂的响应实验研究,首次提出GA调控植物伸长生长存在两条信号途径, 即G^基础水平信号途径(GA basal level 51,aling pathway)和GA正常水平信 号途径(GA normal level 51,aling pathway),而乙烯以及高浓的GA合成抑制 剂(如队C)是通过第一条途径(GA基础水平信号途径)起作用。光形态建 成中对植株生长的抑制作用存在独立于GA的信号途径。 突变体gaid的根系在强光照(63.5件Es一m一,)和培养基内(低氧)的生长 条件下,表现出弯曲、变短、加粗等异常性状,而随光照强度的减弱,这种根 系异常生长的表型也减弱,在暗培养中则完全消失,但无论在哪种环境条件下, 相对野生型对照而言,突变体的种子根短、侧根少。低浓度的ABA(10一SM) 可以恢复突变体gal’d根系在强光低氧条件下的正常生长发育。然而利用IAA及 其极性运输的抑制剂(TmA)、乙烯生物合成前提物(ACC)及合成抑制剂(AOA) 处理突变体gal’d,并没有发现突变体根系的生长发育得到恢复。 突变体gaid可能是一个新的属于小麦GA信号途径中的负调控基因 (GAID)发生了突变或超表达,导致其负调控作用增强,呈现半显性的矮化突 变。在与另一已知小麦GA信号途径中的负调控基因RHT的关系研究上发现, GAID可能对RHT蛋白磷酸化后的降解途径起抑制作用。通过双向电泳发现突 变体gal’d与野生型对照(京冬1号)在生长过程中存在差异蛋白,这将有助于 对GA信号途径分子机理的深入研究。 关键词:春化作用,小麦(Triticum aestivum.L),cDNA文库,启动子,矮化突 变体,GA信号途径 少


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