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植物体内谷胱甘肽还原酶的功能研究

丁顺华  
【摘要】: 谷胱甘肽还原酶(GR,EC1.6.4.2)是一重要的抗氧化酶,许多生理学和遗传工程研究都证明GR酶在抗氧化中的重要作用。但改变GR酶怎样影响植物的抗氧化系统却不清楚。GR是抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径中的重要组成部分,其功能必然与其密切相关。本文用RNAi技术获得具有较低GR酶活性的转基因烟草,系统测定了非胁迫条件和胁迫条件下抗坏血酸-谷胱甘肽循环的变化,得出以下主要结果: 1.选择一烟草叶绿体GR酶编码基因(X76293, gi: 431954)进行RNAi载体构建,构建好的双元载体转化根癌农杆菌LBA4404,然后侵染转化烟草叶圆片。获得的转基因烟草具有30-70%的GR酶活性。分子检测结果表明GR在RNA和蛋白水平上与GR酶活性的变化一致。文中我们第一次用2-D电泳对烟草中GR同工酶进行分析,并确定发生抑制的GR同工酶在细胞中的定位。2-D电泳后的Western杂交检测到烟草的10种GR同工酶,pI值分布在4.5-6.3,其中3种GR同工酶定位在叶绿体内,其蛋白量占据所有GR酶含量的大部分。RNAi发生在叶绿体内和叶绿体外,表明发生抑制的GR同工酶的基因序列具有很高的同源性。igr转基因烟草在表型上与野生型对照烟草无明显差异。 2.所有igr转基因植株和对照植株中的活性氧(O2-和H2O2)、MDA含量和光合作用都无明显差异,表明正常生长条件下GR酶活性的降低不会引起氧化胁迫。测定正常生长条件下igr转基因烟草中谷胱甘肽库的变化。结果表明与对照烟草相比,GR酶活性降低70%会引起转基因植株中GSH/GSSG比率明显降低,而GSH和GSSG的含量稍有增加;测定抗坏血酸-谷胱甘肽循环的变化,结果显示igr转基因烟草中DHAR和MDHAR的酶活性升高,表明非胁迫条件下较低的GR酶活性可能会诱导抗坏血酸-谷胱甘肽循环不能正常的运转。这一作用可能与改变的谷胱甘肽库有关。GR酶活性降低30%的转基因烟草中未检测到这些变化,表明70%的GR酶活对于非胁迫条件下igr转基因烟草可能是足够的。 3. MV处理结果显示,igr转基因烟草的离体叶圆片和活体植株在MV处理后都发生比对照烟草严重的光漂白作用。igr转基因烟草的活性氧和MDA含量明显高于对照烟草,igr转基因烟草的光合作用明显低于对照烟草。以上这些指


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