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雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)虾青素酯和脂肪酸的鉴定及差异表达基因的分析

苗凤萍  
【摘要】: 以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为研究对象,利用高效液相色谱—大气压化学电离正离子质谱鉴定了虾青素酯的各个成份,并建立了测定虾青素含量的HPLC方法;用HPLC及GC-MS的方法研究了雨生红球藻四种类型细胞的虾青素酯和脂肪酸的种类及含量;利用分光光度法和HPLC研究了雨生红球藻虾青素的稳定性;比较研究了酶解和皂化过程中游离虾青素数量变化规律及其得率;并利用抑制性差减杂交技术构建了雨生红球藻中与孢子发育和虾青素形成相关的差减cDNA文库。主要结果如下。 1.利用LC-(APCI)MS鉴定出了雨生红球藻提取物中的4个游离类胡萝卜素,15个虾青素单酯,12个虾青素双酯及3个虾红素单酯。另外,经高效液相色谱—DAD检测到一组化合物的最大吸收在400 nm,正离子模式二次质谱出现有较强的m/z 871和593的分子离子碎片离子特征峰。这组化合物可能是虾红素的亚麻酸或ω-6-γ-亚麻酸酯的异构体,这是以前未见报道的。 2.用HPLC外标法对雨生红球藻中虾青素的含量进行测定。虾青素在0.1-2.0μg线性范围内线性关系良好,其回归方程为:y=1027.3x+245.55,相关系数R~2=0.9997,平均加样回收率为100.277,RSD(%)为2.14。本方法定量准确,重复性好,鉴定出的种类较多,可以作为测定虾青素酯的一种方法。 3.红色游动细胞和红色孢子中的虾青素酯的种类是一致,而且四种类型细胞中的脂肪酸的种类是一致的。另外,红色游动细胞和红色孢子的虾青素酯中主要的几种脂肪酸的含量变化与细胞中总的脂肪酸的含量变化趋势一致。油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)是红色孢子和红色游动细胞中的主要脂肪酸,而且二者在红色孢子和红色游动细胞中的含量远大于绿色孢子和绿色游动细胞中的,说明虾青素酯的形成需要油酸和亚油酸大量地合成。绿色孢子的HPLC图谱与绿色游动细胞的相似,都没有检测到虾青素酯和游离的虾青素。而且,绿色孢子中的脂肪酸组成与绿色游动细胞基本相同,显然,脂肪酸的积累与虾青素的积累密切相关,而与孢子的形成关系不大。红球藻红色孢子中含有30%以上的脂肪酸,并且不饱和的脂肪酸占总脂肪酸的81%,因此,雨生红球藻不仅可以作为珍贵虾青素的较好来源,也可以作为具有较高品质的脂肪酸的来源。 4.氧、温度对虾青素稳定性的作用显著。抗氧化剂VE或VC对虾青素的稳定性起了负作用,加了抗氧化剂的藻粉中虾青素的含量都低于无抗氧化剂的。保存1.5年时,破壁藻粉抽真空后在20℃下保存和藻泥-20℃保存,虾青素的含量和虾青素酯中的各个成份间的相对含量变化不大。保存2年时,虾青素的含量都下降了约10%,藻粉中的虾青素各酯的相对含量变化较大,藻泥中各酯的相对含量仍较稳定。 5.最佳的酶解条件是在反应体系中加入1.02 units的胆固醇酯酶后在37℃下反应75 min,酶解得率是72.04%;最佳皂化条件是加入1.07 mol L~(-1)NaOH在22℃下反应40 min,皂化得率为51.48%。无论是通过酶解还是碱水解,对虾青素酯都具有一定的破坏作用。先水解,特别是先皂化水解虾青素酯,然后用HPLC测定雨生红球藻虾青素含量的方法误差太大,是不可行的。 6.雨生红球藻细胞在胁迫条件下能够积累大量的虾青素,细胞由绿色游动细胞变为红色不动孢子。提取绿色游动细胞和红色孢子中的mRNA,利用抑制性差减杂交技术,成功构建了雨生红球藻中与孢子发育和虾青素形成相关基因的差减cDNA文库。以管家基因α-tubulin作为差减指标,检测到差减cDNA文库的差减效率可高达2~(10)-2~(15)倍,表明在红色孢子中某些差异表达基因包括与孢子发育和虾青素形成相关的基因的富集效率也接近2~(10)-2~(15)倍。雨生红球藻中与孢子发育和虾青素形成相关基因的差减cDNA文库的建立对快速分离、克隆孢子发育及虾青素形成相关基因和认识雨生红球藻中积累虾青素的分子机理有重要意义。


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