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柱状黄杆菌毒力相关因子的研究

谢海侠  
【摘要】:柱形病是一种全球性的危害极广的细菌性病,其病原为黄杆菌科的柱状黄杆菌(Flabobacterium columnare)。柱形病主要危害鱼类的鳃组织,也可引起体表溃乱。细菌性烂鳃病在我国流行较广且危害严重,是草鱼(Ctenopharyngdon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等重要养殖鱼类的主要病原。本研究以我国分离的引起柱形病的病原为对象,开展了柱状黄杆菌的毒力因子基因的鉴定方面的研究,并对其中的一些毒力因子的功能开展了研究,为最终研制弱毒苗奠定基础。 通过对16S rDNA和16S-23S rDNA基因间隔区序列的研究,对从草鱼鱼种上分离的,当时被定名为鱼害粘球菌(Myxococcus piscicola Lu, Nie Ko, 1975)的细菌性病原的进化关系进行订正,系统树关系表明鱼害粘球菌与已报道的柱状黄杆菌以100%的支持率和极小的遗传变异(对于16S rDNA,为0.8%,而16S-23S rDNA为0.0%)聚为一支,表明鱼害粘球菌为柱状黄杆菌的同物异名。 构建了柱状黄杆菌的三个平行表达文库,制备了抗其外膜蛋白(OMPs)的兔抗。对文库进行影印后进行菌落原位杂交,挑取阳性克隆,测序分析,采用基因组步移的方法进行全长克隆,获得4类基因:滑动相关基因、血清抗性相关基因、膜相关的蛋白酶类及胞外胶原酶及蛋白酶基因。此外,通过简并引物获得了柱状黄杆菌的降解多糖的酶-硫酸软骨素AC裂解酶。 对滑动基因gldH与gldJ这两个基因进行原核表达,制备兔抗,然后将柱状黄杆菌通过超速离心进行细胞分相,通过Western-blotting,将GldH及GldJ定位在细菌的外膜相。此外,借助同源双交换,缺失滑动基因gldH内部约300 bp片段并定向插入抗性筛选标记,获得突变子,对突变子的菌落形态的改变、细胞壁荚膜多糖层变化、滑动能力及粘附特性进行了分析,发现突变子菌落边缘假根消失,菌落变得很平滑; 荚膜多糖层变薄; 滑动能力丢失; 粘附能力只有野生型的约1/4。 通过设计简并引物,获得了硫酸软骨素AC裂解酶的基因片段,然后通过基因组步移方法,获得了其全长。对其全长进行原核表达,在非变性条件下纯化重组硫酸软骨素AC裂解酶,并将硫酸软骨素A加入到柱状黄杆菌培养基中诱导天


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