球形芽孢杆菌杀蚊毒素基因的克隆、序列分析及表达

【摘要】： 不同的球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus，B.s）菌株对蚊幼虫具有不同的杀 蚊活性和杀虫谱，其中IAB872对敏感致倦库蚊高毒，对B.s抗性致倦库蚊中毒， 而LP1-G菌株对两种蚊虫品系都具有中度毒杀作用。为了探讨B.s菌株间杀蚊活 性和杀蚊谱差异的分子基础，本文进行了IAB872菌株和LP1-G菌株杀蚊毒素基 因的克隆、序列分析和表达。 IAB872菌株的二元毒素基因位于其染色体—3.5Kb HindⅢ片段上。IAB872 菌株的总DNA经HindⅢ完全酶切后，回收3.5Kb左右的片段，连接于穿梭载 体pBU4上，利用Southern blot和酶切鉴定筛选出含有二元毒素基因所在3.5Kb HindⅢ外源片段的重组质粒pBS-1，随之再构建与pBS-1外源片段连接方向相 反的重组质粒pBS-2。测序结果表明外源片段由3479个核苷酸组成，其上二元 毒素基因的核苷酸序列与2362菌株二元毒素的核苷酸序列完全相同。将pBS-1 和pBS-2电激转入苏云金杆菌无晶体型菌株4Q-7（cry~-）中获得转化菌株Bt-BS1 和Bt-BS2，SDS-PAGE和Western blot检测证实了IAB872菌株的二元毒素基因 在转化菌株中获得了表达，在电镜下可观察到表达的二元毒素蛋白在转化菌株中 形成了菱形和不规则形晶体。转化菌株的生测结果表明Bt-BS1和Bt-BS2对敏感 蚊幼虫的毒力与野生株IAB872相当，均对敏感蚊幼虫具有高毒力，LC_(50)值分别 为2.32×10~(-6)和5.89×10~(-7)，但与IAB872野生株的杀蚊活性不同的是，转化菌株 对抗性蚊幼虫完全无毒，所以IAB872菌株对抗性蚊幼虫的毒力可能是作用机理 不同于二无毒素的Mtx毒素或其它毒素造成的。此外，Bt-BS2的杀蚊毒力高于 Bt-BS1，Bt-BS1和Bt-BS2对蚊幼虫毒力的不同可能是由于重组质粒上外源片段 的插入方向影响二元毒素基因在受体菌中的表达水平的缘故。 另外，本论文还将LP1-G菌株的杀蚊毒素基因在E.coli中进行了克隆。LP1-G 菌株的总DNA经HindⅢ随机不完全酶切，纯化后的酶切产物与pUC18载体连 接后转化，筛选E.coli转化子，构建部分基因组文库。通过生测的方法从E.coli 转化子中筛选出一株对敏感和抗性蚊幼虫均有中等毒力的菌株E-UL68，其对敏 感和C3-41抗性蚊幼虫的LC_(50)分别为2.58×10~(-4)和3.66×10~(-4)，与LP1-G野生株 的毒力相当。测序结果表明外源片段由3876个核苷酸组成，其编码区的核苷酸 中国科学院硕士研究生毕业论文 序列与SSll．l菌株的mtrl基因完全相同。因为＊心中二元毒素基因的表达产 物对敏感和抗性蚊幼虫完全无毒，但该茵株抱子囊时期的发酵液对敏感和抗性蚊 幼虫具有中等的毒力，因此，推测 LP IG菌株对蚊幼虫的毒力可能是由于该菌 株的mtrl基因表达产生的杀蚊毒素或者该菌株在芽抱形成期表达的其它杀蚊活 性因子引起的。