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甲基对硫磷水解酶(MPH)的纯化、性质及酶制剂的研究

楚晓娜  
【摘要】: 本论文研究了甲基对硫磷水解酶MPH(methyl parathion hydrolase E.C.3.1.8.1)的纯化步骤、理化性质及动力学参数,优化了生产Pseudomonas sp WBC-3的产酶培养基,研究了粗酶乳剂的制备。 我们根据Pseudomonas sp WBC-3的生长特性及产酶情况,以阳离子交换层析纯化胞内粗蛋白中,使酶的比活提高了49.1倍,得到了均一的目的蛋白MPH,SDS-PAGE验证为单一的条带,。比较了该菌和Flavobacterium sp.中的粗酶对不同底物的酶活,该菌中MPH水解甲基对硫磷和杀螟松的比活大于Flavobacterium sp.中的OPH(organophosphorase hydrolasc),而水解乙基对硫磷的比活则小于OPH。根据对纯化后的MPH的理化性质及动力学参数的研究表明,该酶催化水解反应最适pH为11.0;最适反应温度为40℃;该酶从40℃到60℃的热稳效果较好,70℃以上则很容易失活;Cd~(2+)和Fe~(2+)对酶有明显的促进作用,而Hg~(2+),Zn~(2+),Al~(3+)和Bi~(3+)则明显地抑制酶的水解反应;对该酶变性后及变性前的分子量的比较表明该酶为一个分子量约为34,250Dalton的单体。甲基对硫磷为该酶的最适底物,K_m为0.0807mM,k_(cat)为2.1×10~6min~(-1)。比较该酶分别作用于甲基对硫磷,乙基对硫磷及杀螟松的K_m、k_(cat)的值可知,该酶对甲基对硫磷的底物亲和力最大,水解效率最高。其次为杀螟松,最后为乙基对硫磷。GC和HPLC的结果显示MPH还可以降解毒死蜱。 我们对生产菌种Pseudomonas sp WBC-3的培养基进行了摸索和优化,得出了既经济又可以高效产酶的培养基配方。在此基础上,还用发酵获得的粗酶液与不同类型的乳化剂配比,制备乳剂,并对比研究了各自的保存时间和条件,从中得到了具应用价值的乳剂配方。


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