球形芽孢杆菌100KD杀蚊毒素和Cyt1Aa毒素在苏云金芽孢杆菌中的协同作用

【摘要】： Mtx1(100 kD mosquitocidal toxin)杀蚊毒素是一种在球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus,B.s)营养体期表达的毒素蛋白，其纯化蛋白对蚊幼的毒力与二元毒素相当。但它在野生型菌株中的表达量低，易被蛋白酶降解失活。 为了提高Mtx1杀蚊毒素蛋白的表达量和稳定性，本文将来源于球形芽孢杆菌B.sSSⅡ-1的mtx1毒素基因克隆至穿梭载体pBU4上，得到mtx1插入方向相反的重组质粒pMT9和pMT4。含有pMT9和pMT4的大肠杆菌转化子能表达产生Mtx1毒素，发酵液对敏感和抗性致倦库蚊幼虫具有中度毒杀作用；含有pMT9和pMT4的苏云金芽孢杆菌转化子B-pMT9和B-pMT4在营养体生长阶段对敏感蚊幼和抗性幼虫也具有毒性，毒力与野生型B.sSSⅡ-1相当，而不同转化子在芽孢形成期的毒力因插入的mtx1基因转录方向不同而表现出差异，其中B-pMT4对目标蚊幼毒力极低(LC_(50)＞10mg／mL)，而B-pMT9对蚊幼虫具有毒性(LC_(50)=2.49mg／mL)。同时，将来源于苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis,B.t.i)的cytlAa基因和P20伴侣蛋白基因克隆连接到质粒pMT9中，并转化到苏云金芽孢杆菌无晶体型中得到重组转化子B-pMPX2，电镜观察发现重组转化子B-pMPX2形成一菱形晶体。SDS-PAGE电泳证明转化子B－pMPX2中Cyt1Aa蛋白过量表达。生物测定结果表明B-pMPX2无论在营养体期还是在芽孢期，对敏感和抗性致倦库蚊具有中毒毒杀作用，而且其杀蚊毒力稳定，与mtx1在蛋白酶缺陷型的菌株表达情况类似。同时，对不同稀释度的重组菌株最终发酵液以及B.sSSⅡ－1营养体期发酵液分段时间的毒力曲线表明，在P20蛋白作用下，Cyt1Aa与Mtx1毒素具有一定的协同作用。生物测定结果表明，在对致倦库蚊蚊幼95％致死浓度下，B－pMT9、B－pMPX2和只含cyt1Aa基因的B－pBA30对3-4致倦库蚊的LT_(50)值分别为28.53h、17.22h和7.61h，说明Cyt1Aa毒素能够提高Mtx1毒素的杀蚊速度。