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甲基对硫磷水解酶的研究

刘璐璐  
【摘要】: 2001年我室筛选出一株甲基对硫磷降解菌, 命名为Pseudomonas sp. WBC-3。 此菌可以以甲基对硫磷为唯一碳源、氮源,将其彻底降解作为生长基质。在对该菌的研究中发现,定位于大质粒上的甲基对硫磷水解酶基因是一个新的基因,命名为mph,该基因完全有别于研究最深的有机磷水解酶基因opd。有机磷水解酶OPH(organophosphorus hydrolase E.C.3.1.8.1)与甲基对硫磷水解酶MPH(methyl parathion hydrolase E.C.3.1.8.1)无论在基因水平上还是蛋白水平上都有很大不同。甲基对硫磷水解酶(MPH)除了可以降解甲基对硫磷外,还可以降解杀螟松,乙基对硫磷,毒死蜱,但降解效率依次降低。对MPH纯酶的底物特异性研究中发现:它水解甲基对硫磷的比活力是水解乙基对硫磷比活力的20余倍。Pseudomonas sp.WBC-3以它诸多方面的特性势必成为有机磷降解菌家族中得力的一员。 随着对这株菌及其中mph基因研究的逐渐深入,我们尝试了将降解甲基对硫磷水解酶的基因mph在异源宿主大肠杆菌系统AD494(DE3)/ pET32a(+)中表达,获得AD494(DE3)/ pET32a(+)-mph重组系统。此系统不仅可以大量表达可溶性的融合甲基对硫磷水解酶(TrxA-His·tag-MPH,THMPA),THMPA又有如下改进:1.在一定蛋白浓度下,重组酶要明显比野生酶稳定。2.重组酶水解乙基对硫磷的比活力是野生酶3倍。稳定性和催化活力对酶来说是很重要的性质,THMPA能在异源宿主表达中获得这些新的特性,在令我们感到欣喜之余,也触动我们探索其改变的原因,为此我们展开了一系列试验进行论证,结果表明:1.重组酶以融合形式存在有利于结构和功能的稳定。2.重组酶的融合成分硫氧还蛋白在THMPA折叠成熟的过程中可能发挥了类似分子伴侣的作用,促进THMPA形成了新的构象,新构象有利于水解乙基对硫磷。 基于重组酶的稳定性和水解活力的提高,采用分光光度法建立了快速检测痕量农药甲基对硫磷和乙基对硫磷的反应体系。该体系对两种底物农药的检测下限为0.05 μM,且在0.05~100 μM的检测范围内建立起了良好的线性关系。 利用AD494(DE3)/ pET32a(+)-mph表达系统,通过Error prone PCR方法对mph基因进行体外定向分子进化,期望在保留THMPA特性的同时,获得提 WP=6 高底物水解活力的突变株。筛选方法及条件得到了优化,共对约30000个突变株进行了筛选,但未发现有对甲基对硫磷、乙基对硫磷、杀螟松三种底物水解活性明显提高的菌株,推测可能由于THMPA的结构已经处于最佳状态,很难通过随机突变的方法获得进化。


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