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有机污染物降解菌的基因克隆、突变型筛选及趋化研究

赵非  
【摘要】:全文工作共分为三部分: 第一部分:Pseudomonas putida WBC-3能够利用有机磷农药甲基对硫磷(MP)为唯一碳、氮源及能源生长,其质粒上一段包含完整甲基对硫磷水解酶基因(mph,GenBank accession No. AY251554)的3.7kb片段已经被克隆。该基因与已报道的mpd基因(GenBank accession No. AF338729)在氨基酸水平的相似性达98%。为鉴定该基因的功能,mph基因被克隆得到克隆子W3M193。W3M193获得了将MP转化为黄色化合物的能力。通过测定Pseudomonas putida WBC-3和W3M193的细胞破碎液对MP、乙基对硫磷及杀螟松的降解活性,发现来源不同的MPH功能相同,活性相似,确定mph为甲基对硫磷水解酶基因。 第二部分:Pseudomonas sp. ZWL73利用对氯硝基苯 (4CNB) 为唯一碳、氮源及能源生长,其4CNB降解能力是由质粒编码控制的。为了克隆得到该菌降解4CNB的相关基因,质粒转座子(plaposon)被随机插入野生菌产生突变,并筛选得到2株4CNB降解缺陷型。利用转座子上含有的条件复制起始点克隆了2株缺陷型中转座子插入位点的侧翼片段,测序并对序列进行了分析。结果显示,一个克隆可能来自原降解菌的染色体,包括部分hlsU基因、完整的一段功能未知的假定保守蛋白基因和部分多聚3-羟基烷羧酸聚合酶1的编码基因;另一亚克隆可能含有部分铬离子转移酶基因。 第三部分:利用趋化检测方法测定了Pseudomonas sp. ZWL73及其接合转移子(获得4CNB降解质粒的恶臭假单胞菌PaW340)对4CNB及其它可能同4CNB降解相关的多种化合物的反应能力。结果发现两种菌株对4CNB和包括对氯苯胺、邻氨基酚和2-氨基-5-氯酚在内的其它13种化合物均表现出趋化性,而这些化合物大多能被用作ZWL73的生长底物。这一结果显示了ZWL73对4CNB及其降解中间产物的趋化与降解转化之间的相关性。两株菌对测试的化合物具有相同的趋化谱也表明ZWL73对4CNB的趋化也是由编码4CNB降解功能的质粒所控制的。


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