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活细胞内脊髓灰质炎病毒正链RNA可视化研究

崔宗强  
【摘要】:病毒核酸在寄主细胞内定位和运动的监测分析对于理解病毒与宿主细胞间的相互作用具有重要意义。但是迄今为止,要实现病毒核酸在寄主细胞内定位和运动的分析,特别是要实现病毒核酸在活细胞内的动态学及其控制机制的分析,还存在方法学上的不足和挑战。 利用分子信标技术和脊髓灰质炎病毒-Vero 细胞作为模型病毒-细胞系统,本研究建立了一种在活的寄主细胞内实现病毒核酸可视化的方法。当把目标RNA特异性的分子信标探针引入脊髓灰质炎病毒感染的Vero 细胞内时,内源的脊髓灰质炎病毒的正链RNA 可以在活细胞内被标记照亮。在荧光显微镜下可以直接监测脊髓灰质炎病毒的正链RNA 在活细胞内的定位和运动。这一结果也证明了分子信标是实现病毒核酸在活细胞内可视化的有力工具。 运用长时间活细胞荧光影像捕获和荧光漂白恢复等技术手段,研究了脊髓灰质炎病毒正链RNA 在活细胞内的行为特征。在病毒感染后的不同时间,脊髓灰质炎病毒正链RNA 在寄主活细胞内展示不同的分布模式。实时监测发现脊髓灰质炎病毒正链RNA 在Vero 细胞内的分布变化是一个特征性的RNA 移位过程。由于这一移位过程类似于脊髓灰质炎病毒诱导的特异性膜泡在寄主细胞内的重排过程,我们把这种RNA 移位也称为RNA 的重排。脊髓灰质炎病毒正链RNA 特征性的移位和重排需要寄主细胞完整的微管网络,破坏微管网络可以改变RNA 的分布模式。荧光漂白恢复检测显示约有49.4 ±3.2%的脊髓灰质炎病毒正链RNA 在其分布区域内部可以自由扩散运动(扩散系数为9.6 ±1.6×10~(-10) cm~2/s),其余的50.5 ±2.9%在FRAP 测定期间几乎静止不动,而只是随着整个RNA 分布区域的变化缓慢移动。活细胞内的研究揭示了脊髓灰质炎病毒正链RNA 以一种受限制和自由扩散相混合的复杂的分布和运动机制存在于寄主细胞。这种机制主要与寄主细胞的微管和病毒诱导的膜结构有关。这一病毒核酸在活的寄主细胞的动态行为的研究也让我们对脊髓灰质炎病毒和寄主细胞的相互作用有了更深的理解。 通过电子显微镜的观察,发现脊髓灰质炎病毒诱导的膜重排过程也与微管组织有关。结合文献资料和本研究的发现,我们猜想脊髓灰质炎感染细胞后,伴随膜重排的过程,寄主细胞内还可能有一个特征性的微管重排过程。


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