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Pseudomonas putida ZWL73降解4-氯硝基苯的研究

镇达  
【摘要】: Pseudomonas putida ZWL73分离于4-氯硝基苯(4CNB)污染土壤,可以以4CNB为唯一的碳氮源生长,并从底物释放氯离子和铵根离子。通过对降解菌的细胞提取物的酶学分析检测到对4CNB的硝基还原酶活性及推测的开环底物2-氨基-5-氯酚(2A5CP)的开环双加氧酶活性,结合生长底物范围因素(如完全还原产物对氯苯胺不能被利用生长)以及通过GC-MS检测到对氯亚硝基苯在培养基中的生成和转化实验结果,推测ZWL73是通过部分还原途径降解4CNB。质粒消除和接合转移显示降解菌具有的100kb的质粒参与了4CNB的降解,其证据来自于:质粒消除菌失去了野生型所具有的硝基还原酶和2A5CP开环双加氧酶活性;质粒消除后的菌株不能在底物培养基上生长,而其质粒转移到受体菌后使后者获得了在4CNB上生长的能力。ZWL73是第一个鉴定了4CNB的降解途径编码在质粒上的菌株。通过构建质粒DNA文库,筛选得到一个具有对2A5CP具有活性的克隆子,通过亚克隆得到一个4.9kb EcoRI片段,测序后对序列分析表明片段上的两个基因cnbCaCb分别编码了间位开环双加氧酶的β和α亚基;在大肠杆菌中过量表达的蛋白显示了对2A5CP及2-氨基酚(2AP)的活性,同时对邻苯二酚及原儿茶酸具有较弱的活性;对2A5CP及2AP的K_m值分别为4.117、7.954μM,说明2A5CP是2A5CP双加氧酶(2A5CPDO)的天然底物。 进化分析表明2A5CP双加氧酶属于classIII的间位开环双加氧酶; CnbCa与其它2AP开环双加氧酶具有较近的亲缘关系,但是与其它不同来源的classIII间位开环双加氧酶的序列一致性很低(8.3-18.7%);2A5CPDO的两个亚基具有25.8%一致性,但是α亚基序列缺少酶活性中心必要的保守His位点。可以推测两个亚基具有共同的进化起源并与其它2AP开环双加氧酶形成一个classIII间位开环双加氧酶中的新的亚类。 通过氨基酸序列的多重序列比对分析推测2A5CPDOβ亚基CnbCa的三个保守His残基His13、His62、His195在催化活性中心可能是辅基Fe~(2+)的结合位点。通过构建含有突变位点cnbCaCb的重组表达载体和过量表达获得了分别含有H13A、H62A和H195A(His突变为Ala)突变的突变蛋白。对含突变氨基酸的2A5CPDO活性分析表明三个突变蛋白均失去了野生型的活性。突变蛋白和野生型氨基酸序列


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