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代谢工程方法降解六氯苯的研究

闫达中  
【摘要】: 六氯苯(Hexachlorobenzene,C6Cl6,简称HCB)的化学性质稳定,很难降解,对生态环境具毒性效应,被《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》列为12种持久性有机污染物(persistent organic pollutants,POPs)之一。由于目前尚未分离到可以矿化六氯苯的纯培养物,因此得到可彻底降解六氯苯的工程菌,解决六氯苯的难降解问题,具有重要的理论和实际意义。 本研究首先探讨了共培养E. coli DH5α[pCWSGB-camC]与ATCC39723降解六氯苯的可能性。 接着利用同源重组方法将表达单元cam A+B+C定点重组在五氯酚降解菌ATCC39723非必需基因pcpM上,把五氯酚降解菌改造成六氯苯降解菌。利用气相色谱(GC-ECD)对重组工程菌ZWY005进行功能测定,在重组工程菌细胞培养液中加入4.3μM六氯苯,6小时后菌液经过正己烷萃取,气相分析结果显示细胞培养液中六氯苯绝大部分已经完全降解(只有痕量的六氯苯残余),降解速度为0.67 nmol·mg(细胞干重)-1·h-1。 由于ATCC39723降解五氯酚的相关代谢基因的表达需要底物五氯酚的诱导,诱导时间大约需1~2小时,因此在重组工程菌细胞培养液中加入六氯苯后,两小时内产生的五氯酚不会降解可以检测到。重组工程菌细胞培养液中加入六氯苯两小时后,菌液经过丙酮∶正己烷(1∶1)萃取,乙酸酐衍生。气相色谱结果表明重组工程菌ZWY005降解六氯苯过程中的确有五氯酚生成,其衍生物的保留时间与标准品五氯酚衍生后生成的衍生物乙酸五氯苯酯保留时间相同。进一步利用气相色谱质谱联用技术(GC-MS)对中间产物五氯酚进行了鉴定。最后尝试性探索了采用genome shuffling方法对工程菌ZWY005进行诱变、融合,结合有效地筛选,以期望最终获得以六氯苯为唯一碳源和能源生长的突变株的可能性。


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