苏云金芽孢杆菌杀虫晶体的遗传改良及plcR基因功能研究

【摘要】： 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)制剂自1938年在法国首次问世以来,就以其杀虫特异性强,不污染环境和对人畜无害,而成为目前应用最广也是年产量最大的生物杀虫剂。但是Bt制剂存在一些不足,如杀虫谱较窄,毒力不强且作用较为缓慢,昆虫易产生抗性等,因此有必要开发新的Bt资源,并对现有Bt株系进行遗传改良。研究表明,Bt不同Cry蛋白之间毒性区域的结构域交换是获得新的高毒力Bt工程菌的有效途径,另外,Bt染色体上一些调控基因的敲除也为Bt杀虫菌的遗传改良提供了一些新的启示。本文主要围绕以下两点进行研究。 (1)采用体外重组技术,将对鳞翅目有较高的毒性的Cry1Aa和对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾有中等毒杀作用的Cry1Ca两晶体蛋白相应结构域进行互换,得到6株重组菌株BT-ACC、BT-AAC、BT-ACA、BT-CAA、BT-CCA和BT-CAC,经SDS-PAGE和Western Blot分析表明,仅重组菌株BT-CAA和BT-CCA能表达产生135 kDa左右的杂交晶体蛋白Cry1CAA和Cry1CCA,但其蛋白表达量较野生型Cry1Aa和Cry1Ca低。用牛胰蛋白酶对杂交晶体蛋白Cry1CAA、Cry1CCA及野生型Cry1Aa和Cry1Ca进行消化,证明所有晶体蛋白都能产生65kDa的活性毒素。电镜观察发现,野生菌株BT-Cry1Aa和BT-Cry1Ca形成典型的菱形晶体,而重组菌株BT-CCA和BT-CAA则形成球形或颗粒状杂交晶体。纯化晶体的生物测定显示,杂交晶体蛋白Cry1CAA和Cry1CCA对甜菜夜蛾的毒力比野生型晶体蛋白降低3-5倍,对棉铃虫的毒力比野生型晶体蛋白降低了190-260倍。研究结果表明,苏云金杆菌晶体蛋白不同结构域的相互作用会影响杂交晶体蛋白的表达、晶体形态和杀虫活性。 (2)PlcR是广泛存在于苏云金杆菌和蜡状芽孢杆菌(B. cerecus)中的一个多效调控因子,它可以激活多种编码毒力因子的基因的表达。苏云金杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bti)对蚊幼虫具有较高的毒杀作用,也是应用最早最广泛的一个杀蚊Bt菌株。利用基因敲除技术将位于Bti AND672染色体上的plcR基因缺失,结果发现,plcR基因缺失可以提高突变菌株在LB培养基中生长的菌密度,导致单位体积伴胞晶体蛋白产量提高,其中缺