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H5N1/H7N8/H10N4禽流感病毒的分子特征及致病性研究

唐霜  
【摘要】: 本研究主要对2006年春季在青海湖地区开展的候鸟禽流感病毒流行病学调查的样品,运用夹心ELISA方法筛选AIV抗原阳性样品,以鸡胚增殖培养分离禽流感病毒,从患病濒死的斑头雁、大天鹅和红嘴鸥内脏中分离得到的3株高致病性H5N1禽流感病毒:A/Bar-headed Goose/Qinghai/F/2006(H5N1)、Whooper swan/Qinghai/01/2006(H5N1)和A/Black-headed gull/Qinghai/3/2006(H5N1)。通过对3株病毒的全基因组序列分析与进化研究,其分子特征分析结果显示:Whooper swan/Qinghai/01/2006株和Bar-headed Goose/Qinghai/F/2006株的PB1基因的核苷酸序列同源性为94%之外,3株病毒其余基因片段的核苷酸序列同源性为99%。以A/Black-headed gull/Qinghai/3/2006为代表与2005年青海湖、西伯利亚候鸟AIV毒株核苷酸序列相比同源性为99%。3株病毒HA蛋白的氨基酸裂解位点序列均为-RRRKKR-,是高致病性禽流感病毒的显著特征。PB2蛋白的第627位为赖氨酸,提示3株分离株具有感染哺乳动物的能力。NA蛋白的茎杆区第49~68位有20个氨基酸的缺失,在M2蛋白穿膜区的Leu26,Val27,Ala30,Ser31等位点都没有出现突变,提示对金刚烷胺类药物与神经氨酸酶抑制类药物未产生抗药性。为进一步揭示3株病毒在候鸟中亚国际迁徙路线上与沿途地区H5N1禽流感病毒的传播关系,选择了迁徙路线上候鸟、家禽和人禽流感H5N1病毒的基因序列共同构建系统进化树分析,结果显示,该3株病毒与2005年青海和西伯利亚的H5N1毒株集聚在一个分支,在亲缘关系上最为接近。3株病毒分别感染雏鸡和小鼠进行致病性实验,结果符合OIE高致病性H5N1的诊断标准,证明3株病毒都为高致病性禽流感病毒,对禽类和哺乳类动物都具有高致病性。 其次,采用基因克隆等分子生物学方法,完成了2株1983年鸭源禽流感病毒的亚型鉴定、序列测定、进化分析及致病性研究。将2株病毒的HA、NA、M、NS、PA、PB1和PB2基因经过RT-PCR扩增,连接到pMD19-T载体,筛选阳性克隆子,酶切鉴定、测序分析。分别鉴定为A/DK/Hubei/137/83(H10N4)和A/DK/Hubei/216/83(H7N8)。前者HA氨基酸剪切位点序列为P-E-V-V-Q-G-R,后者HA剪切位点序列为P-E-I-P-K-R;2株病毒的NA在第48位氨基酸后无20个氨基酸的缺失;NS蛋白的第79~84位也没有氨基酸的缺失,不具有高致病性特征;A/DK/Hubei/216/83(H7N8)与香港1972~1997年不同亚型AIV的同源性为96%~98%,进化分析表明,除NA和PB2独自成一支外,其余5个基因都与1972~1997年毒株亲缘关系较近。A/DK/Hubei/137/83(H10N4)除NA和M基因外,其他5个基因分别独立自成一支。序列相似性分析结果显示,NS、PA、PB1、PB2基因与1997~2004年H5N1 AIV同源性为98%~99%。2株病毒动物感染试验结果显示均为低致病性。


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