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杆状病毒感染的分子机理研究

李祥  
【摘要】: 杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒,作为生物杀虫剂广泛应用于害虫防治,其区别于其他病毒的显著性特征是它具有双相复制周期,在复制过程中产生两种结构与功能不同的病毒粒子类型:出芽病毒(BV)和包涵体病毒(ODV)。虽然对BV和ODV感染的机理进行了大量研究,但仍有许多问题有待进一步解决。本论文研究了棉铃虫核多角体病毒(Heilicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus, HearNPV)编码的成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, fgf)的同源基因vfgf的结构与功能,发现vFGF不仅具有FGF保守的生物学活性如细胞趋化功能,而且还参与HearNPV BV感染过程,是BV感染的必需基因。论文还研究了ODV感染的分子机制,揭示口服感染相关蛋白PIF-3的N端疏水区是PIF-3行使功能所必需的。本研究丰富了杆状病毒感染分子机制的理论。 论文第一章首先综述了杆状病毒的研究现状,主要病毒感染的机制研究进展,较为深入的分析了杆状病毒的膜融合蛋白的特点和感染机理,及病毒口服感染相关基因的结构与功能研究的主要进展。介绍了脊椎动物和无脊椎动物中FGF研究现状及其存在的问题和发展趋势。最后,结合对研究进展的分析提出了本论文的目的意义。 第二章研究了HearNPV vFGF基本特性及其在BV感染中的作用。转录和翻译结果显示vfgf是一个晚期表达基因。HearNPV编码一36 kDa的vFGF,能特异地趋化HearNPV敏感的细胞Hz-AM1,而对其它非敏感的昆虫细胞如Sf9和Se-UCR及哺乳动物细胞如293和HepG2都没有趋化能力。HearNPV vFGF能与肝素进行特异结合,利用这一特性我们在病毒感染细胞的上清中检测到了vHaFGF的存在,表明vHaFGF是一个分泌蛋白,暗示了它作为胞外的配体能跟肝素结合在信号传导过程中起作用。此外,Western blot和免疫胶体金技术结果证明vFGF是BV的结构蛋白且定位于BV的囊膜,而ODV上没有vFGF存在,这种定位进一步为趋化实验和抗体中和所证实。缺失vfgf的重组HearNPV进行转染和感染试验发现该重组病毒不能进行二次感染,而恢复vfgf后能正常感染。这些结果表明HearNPV vfgf是HearNPV BV感染的必需基因。论文进一步讨论了vFGF在病毒的感染和致病过程中的作用。 第三章对AcMNPV PIF-3的基本特征和N端疏水区的功能进行了研究。RT-PCR和Western blot结果表明pif-3是一个晚期表达基因,编码25 kDa的蛋白,Western blot分析证明其为ODV的结构蛋白。亚细胞定位研究结果证明PIF-3 N端富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的疏水区行使核定位信号的作用,在蛋白运输到细胞核中发挥作用。通过red重组系统我们构建了PIF-3的缺失重组病毒,经口服感染和注射实验表明缺失pif-3使AcMNPV失去了口服感染能力但对BV的感染性没有影响,而恢复完整的PIF-3拯救了病毒的口服感染能力,但是恢复缺失N端23个氨基酸的疏水区的pif-3则不能拯救病毒的口服感染能力。一步生长曲线结果显示PIF-3或其跨膜区的缺失对病毒的复制、包装和出芽等过程没有明显的影响。 论文首次揭示HearNPV编码的vFGF参与BV的感染过程,是除杆状病毒BV膜蛋白(GP64或F蛋白)之外发现的又一个由病毒编码的结构蛋白,为进一步研究杆状病毒感染的分子机制提供了新的途径;同时还发现PIF-3的N端疏水序列作为核定位信号引导蛋白进入细胞核并在AcMNPV初级感染过程中起决定性作用,为进一步揭示ODV感染的机理提供了一个新的思路。


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