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噬菌体展示介导的免疫扩增病原检测方法研究

郭永超  
【摘要】: 当前感染性疾病的严峻现状和生物恐怖的潜在威胁使病原微生物的检测面临严重的挑战。本研究发展了一种新的病原检测方法,称为噬菌体展示介导的免疫扩增病原检测方法。该方法巧妙地利用了表面展示有单链抗体的重组噬菌体本身具有抗原结合分子和内部含有DNA的特点,通过表面展示的抗体识别目标抗原,利用内部的DNA作为核酸扩增的模板,把重组噬菌体作为载体直接介导完成免疫识别和信号检测过程。根据信号扩增方法的不同,可以分为噬菌体展示介导的免疫PCR和噬菌体展示介导的恒温扩增两种方法。噬菌体展示介导的免疫PCR是一种新型的免疫PCR方法,它利用重组噬菌体作为免疫PCR的载体。以汉坦病毒核蛋白为例,本研究论证了噬菌体展示介导的免疫PCR方法是一种高灵敏的病原检测方法,灵敏度比传统的酶联免疫吸附(ELISA)方法提高1,000-10,000倍,达到10 pg/ml。同时利用Real-time PCR技术结合标准曲线使该方法能够对抗原定量检测。检测结果表明重复性较好,在夹心检测的模式下2,000ng/ml到2 ng/ml的检测范围内R~2值达到0.96。本研究随后用恒温扩增方法代替PCR扩增噬菌体DNA发展噬菌体展示介导的恒温扩增方法,希望能摆脱对热循环仪的依赖。首先尝试噬菌体展示介导滚环扩增方法,该方法检测HIV P24抗原的灵敏度为100 pg/ml,但是所需的时间较长,而且检测的特异性不强。随后采用链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)以取代滚环扩增作为信号检测的方法发展了噬菌体展示介导免疫链置换扩增方法。链置换扩增的效率很高,反应时间只需一个小时,检测HIV P24抗原和HBV HBsAg的灵敏度比传统的ELISA方法灵敏度提高1,000-10,000倍,同时结合荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针做实时监测,使该方法的特异性大大增强。本研究发展的噬菌体展示介导的免疫扩增检测方法兼具免疫学检测方法的高特异性和核酸扩增方法的高灵敏度,而且成本低廉,有希望推广使用成为一种病原检测的常规方法。


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