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SARS和SARS样冠状病毒遗传进化及其受体研究

任武泽  
【摘要】: SARS冠状病毒已经证实为2002-2003暴发的SARS疫情的病原。SARS-CoV基因组解析后,SARS的溯源问题成为许多病毒学家及流行病学家关注的热点。我们前期在菊头蝠体内发现了SARS样冠状病毒(SL-CoV),证明蝙蝠是SL-CoV的一个自然宿主。本论文在前期工作的基础上,开展了以下方面的研究,并取得了一些重要结果: 1.测定了两株蝙蝠SL-CoV的全基因组序列,它们来自于马铁菊头蝠和大耳菊头蝠,分别命名为Rf1和Rm1。序列分析表明,蝙蝠SL-CoV Rf1和Rm1具有与SARS-CoV相似的基因组结构,其基因组序列之间的相似率为87-92%。所有蝙蝠SL-CoV基因组序列均含有与SARS-CoV相似的转录调控序列和s2m基序,核衣壳蛋白基因下游也发现存在茎环结构和假扭结结构。蝙蝠SL-CoV变异主要集中于刺突蛋白S、ORF3a和ORF8,其中ORF8只存在于动物来源或早期人SARS-CoV基因组中。遗传分析表明,人和果子狸体内的SARS-CoV与蝙蝠SL-CoV在进化树上聚为独立的分支;虽然同属于Ⅱ类冠状病毒,但有区别于以往发现的Ⅱ类冠状病毒,我们称之为SARS簇冠状病毒或者2b亚类冠状病毒。基于单个基因或开放阅读框构建的系统发生树大体上与全基因组的相同,但是各基因系统发生并非完全一致,提示可能存在重组事件。然而,并无显著证据表明重组事件发生,亦没有发现重组热点。对几个变异较大的基因进行了选择压力检测,发现蝙蝠SL-CoV与果子狸或人SARS-CoV之间均表现为负选择,暗示蝙蝠SL-CoV在蝙蝠体内已经存在了很长时间,且仍处于不断变化之中。虽然目前还没能在蝙蝠体内找到SARS-CoV的祖先序列,但是现有的数据显示,蝙蝠体内携带多种冠状病毒且具有丰富的遗传多样性,可能是迄今发现的所有冠状病毒的宿主。 2.序列比较分析显示,蝙蝠SL-CoV S蛋白相应的受体结合基序内(RBM)缺少了两段氨基酸序列,推测蝙蝠SL-CoV可能使用与SARS-CoV不同的受体。为了验证这一推测,我们利用HIV假病毒系统,构建了含有蝙蝠SL-CoV Rp3 S蛋白的假病毒(HIV/Rp3-S),检测HIV/Rp3-S假病毒对ACE2表达细胞的感染性。结果证明,HIV/Rp3-S不能感染ACE2表达细胞,而SARS-CoV HIV假病毒也不能感染蝙蝠RpACE2表达细胞系,证实了蝙蝠SL-CoV不能利用ACE2作为其细胞受体。 3.为了界定SARS-CoV S1上与其受体ACE2作用的最小区域,我们在Rp3-S基础上构建了一系列含不同长度BJ01-S1片段的S嵌合体,研究了这些嵌合体的细胞表达、假病毒包装及假病毒感染性。在假病毒水平上鉴定了SARS-CoV S蛋白上最小的受体结合区域(RBD)为310-518aa,同时发现不同S嵌合体假病毒进入敏感细胞的效率不同。


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