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中国棉铃虫核多角体病毒(HearNPV)orf107,orf135及pkip基因功能的研究

潘小玉  
【摘要】: 棉铃虫核多角体病毒(HearNPV)是在我国农业生物防治中广泛应用的重要病毒,我们在前期测定棉铃虫病毒基因组序列的基础上,全面开展了HearNPV基因的功能研究。本论文对HearNPV中的三个基因:Ha107,Ha135和Ha130(pkip)基因进行了转录、表达分析、定位等研究,并通过基因缺失初步研究了它们的功能。 第二章的研究发现Ha107预测编码一个51kDa的蛋白。转录分析表明,Ha107在HearNPV感染的HzAM1昆虫细胞中具有两个转录起始位点,一个位于Ha106(superoxide dismutase,sod)的上游,另一个位于Ha107上游。Western blot结果显示,HA107蛋白在HearNPV感染的细胞中具有两种形式,主要形式为48kDa,另一个少量形式为51kDa。Western blot结果同时显示HA107是BV和ODV的核衣壳结构组分。缺失Ha107增加了出芽病毒粒子(BV)的感染性。电镜观察显示Ha107的缺失对包涵体的形成并无显著影响。这些结果表明Ha107编码一个非必需的结构蛋白;对该基因的缺失会导致BV感染性增强。 Ha135预测编码一个23kDa的蛋白。第三章描述了对Ha135的缺失分析和功能鉴定。3'RACE结果表明:在病毒感染后12小时细胞RNA样品中最先检测到Ha135基因的mRNA,并持续到感染末期;并确定了转录的起始和终止位点。Western blot结果显示Ha135编码一个23kDa非结构蛋白。当我们将该蛋白C端与eGFP蛋白融合后,瞬时转染结果显示HA135蛋白定位在细胞核中,并聚集成块状。凝胶分子筛层析以及化学交联实验结果表明HA135蛋白在体外主要以二聚体形式存在。Ha135的缺失并没有显著影响BV生长曲线。Ha135缺失的病毒对棉铃虫幼虫仍具有感染性。 Ha130基因全长510bp,预测编码一个20kDa的蛋白激酶相互作用蛋白(PKIP)。第四章对HearNPV PKIP进行了研究。利用3’RACE对HearNPVpkip的转录进行分析表明:在病毒感染后8小时细胞RNA样品中最先检测到pkip基因的mRNA,并持续到感染末期。Western blot分析显示,pkip的表达产物大小为20kDa,与理论分子量接近。亚细胞定位实验显示,单独表达的PKIP-GFP融合蛋白主要分布在被转染的HzAM1细胞的细胞质中,在病毒超感染后,融合蛋白在核内的分布增多。缺失分析表明pkip不是HearNPV感染的必需基因。


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