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双光子激发激光扫描立体显微成像技术研究

杨延龙  
【摘要】:双光子激发荧光显微成像技术因其内在的光学切片能力和高的光学穿透深度,被广泛应用于生理学、神经生物学、胚胎发育学以及组织工程学等领域。然而,现有的双光子激发荧光显微成像系统通过聚焦的超短脉冲激光的二维扫描完成一幅二维图像的采集,三维成像需要样品台的轴向逐层扫描完成多幅二维图像的采集,这成为制约其三维成像速度的主要原因。本文以双目视觉原理和贝塞尔光束产生的扩展焦场为基础,完成了实验系统的设计和整个光路的物理光学仿真,最终研制出了一套光机电算一体化的双光子激发激光扫描立体显微成像系统原理样机,其三维成像速度比传统的逐点扫描方式提高了一到两个数量级,主要包含以下研究工作:1、提出采用四振镜实现双视角快速切换的立体扫描方法。根据激光扫描的基本原理,提出了由四个振镜组成的激光束立体扫描装置,实现了对贝塞尔光束的横向位置和倾角共三个维度的控制,突破了只有两个自由度的传统激光扫描不能实时切换视角的限制。完成了四振镜立体扫描装置的机械设计和程序控制,实现了对贝塞尔光束的快速扫描,并在毫秒量级进行双视角切换,从而解决了激光扫描立体显微成像系统中双光路同时成像的技术难题。2、建立了双光子激发激光扫描立体显微成像系统的物理光学仿真平台。根据双光子激发荧光激光扫描立体显微成像的机制,提出采用高精度的物理光学仿真框架对成像过程进行模拟。综合利用傅里叶光学方法和瑞利-索末菲衍射积分方法对整个光学系统进行建模,突破了基于光线追迹方法的局限。计算了不同锥镜产生的贝塞尔光束的传播特性,以及锥镜顶角偏离对扩展焦场的影响,计算了扩展焦场的空间频域特性及其对系统的成像性能的影响,为双光子激发激光扫描立体显微成像系统的设计和实现提供了理论指导。3、设计并实现了双光子激发激光扫描立体显微成像和实时立体显示系统。完成了整个显微成像系统和立体显示系统的构建和联调,其中显微成像系统包括飞秒超快光源、四振镜立体扫描装置、中继光路、样品台、信号的采集和处理,立体显示系统包括数据流的实时处理以及基于快门方式的立体显示设备。设计了基于扫描反射镜的扩展焦场的测量光路;开发了系统的硬件控制模块和图像采集与处理的软件模块;编写了基于快门方式的立体显示控制程序,实现了对样品的立体动态成像和实时的双目立体观测。成像系统可对百微米深度的观测区体积实现1.48赫兹的立体成像(512×512像素),横向分辨率约为700纳米。4、提出双光子激发激光扫描立体显微图像的深度信息恢复方法和三维重建方法。根据双视角立体显微图像的对极几何约束关系,利用基于特征检测的立体匹配算法和改进的归一化交叉关联方法,分别实现了对稀疏和稠密的样品进行深度信息恢复和三维重建。综合利用粒子跟踪算法和基于特征检测的立体匹配算法实现了对动态样品的深度信息恢复和三维重建。


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