葫芦素在骨组织工程血管化中的作用及机制研究

【摘要】：血管新生是人体重要的生理过程,在骨组织损伤修复的过程中血管新生尤为重要,缺损部位的血管新生决定了骨修复的程度。血管化是骨组织工程成功实现骨修复的一个关键环节。在传统的多孔骨支架发挥支撑以及成骨诱导作用的基础上,负载稳定可控、安全有效的促血管新生活性因子,将大大提高骨植入物的修复作用。目前已有多种蛋白类生物活性因子用于骨组织工程的血管化,由于其稳定性差以及毒副作用,仍迫切需要开发更加稳定、高效、安全的生物因子。中药及天然产物在我国有着多年临床积累,蕴含着极大的药物资源,大多数天然药物分子稳定、易得,开发其新的功效有重要的临床价值。葫芦素是提取自甜瓜蒂的一类四环三萜类化合物,主要成分为葫芦素B和葫芦素E。葫芦素片在临床上主要用于肝炎及原发性肝癌的辅助治疗。大量的研究报道了葫芦素单体成分毒性剂量下抗肿瘤及促进细胞凋亡的药理作用,但其低剂量下的药物作用鲜有报道。本研究中,我们首次观察到葫芦素在无细胞毒性的安全剂量下有促血管新生作用,继而应用低温3D成型技术,将其负载到高分子材料骨组织工程支架中,在大鼠颅骨缺损的动物模型中观察了载药支架对骨缺损部位血管新生及骨再生的作用,并探讨了药物的作用机制。本论文的主要研究内容包括以下三个方面:1.首次报道了低剂量下葫芦素通过激活血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)及其下游相关的信号分子,促进血管内皮细胞在基质胶上的管腔形成。该部分以人脐静脉血管内皮细胞EA.hy926为体外研究对象,应用CCK-8明确药物无细胞毒性的安全剂量;评价安全剂量下,葫芦素对EA.hy926细胞在基质胶上体外管腔形成的影响,并在斑马鱼胚胎血管损伤模型中验证药物的血管修复作用。检测药物对血管新生重要信号通路VEGFR2及其重要下游分子磷酸化活性的影响。应用生物信息学工具预测了葫芦素可能存在的药物靶点,并对药物的潜在蛋白靶点进行了聚类分析。结果表明,无细胞毒性的低剂量葫芦素B和葫芦素E,均可促进EA.hy926细胞体外的管腔形成,并可修复斑马鱼胚胎期的血管损伤。信息学分析结果表明,葫芦素的药效可能与细胞的代谢及天然免疫有关,进一步的实验表明低剂量葫芦素B和葫芦素E可能是VEGFR2~(Tyr996)的一种激动剂,可通过调控VEGFR2及其下游的信号通路促进内皮细胞的存活和增殖,并可能影响细胞的迁移和极化,从而导致血管新生的发生。2.制备了理化特性良好、药物释放可控的含葫芦素B/葫芦素E的载药复合多孔支架。本部分主要研究内容为载药复合支架的制备及其理化性质的表征。以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和β-磷酸三钙(β-TCP)为支架的主要原料,使用低温3D打印技术制备PLGA-β-TCP-CuB/PLGA-β-TCP-CuE载药支架。采用扫描电镜、Micro-CT、力学测试等手段对支架理化特性进行了表征;采用高效液相色谱技术检测支架中药物的释放;并对支架释放液中药物的活性及细胞相容性进行了相应的评价。结果表明,所制备的支架,孔径大小约为470μM,孔隙率为70%,力学强度良好。支架体外释放模拟结果显示,药物在30天的观察期内呈线性释放,释放液pH值稳定。细胞可黏附于支架表面生长,且药物在低剂量下具有促血管和促成骨的双重作用,可以满足早期血管化及骨组织修复所需的要素。3.含葫芦素的载药复合支架可促进大鼠颅骨临界尺寸骨缺损模型中骨缺损部位的血管新生及骨再生。本部分的研究采用大鼠颅骨临界尺寸骨缺损模型,应用影像学、组织学等多种手段,评价负载了葫芦素的含药支架在体内诱导血管新生进而促进骨再生的作用。MRI动态监测结果显示,与假手术组及空白支架组相比,含药支架组中缺损部位的血流信号显著增强。Micro-CT可见载药支架组缺损部位新生血管数量显著增多。组织学结果显示,载药支架组促血管新生的重要因子VEGF及HIF-1α蛋白表达显著上调。X-Ray和Micro-CT影像学数据显示,载药支架组的骨量高于假手术组及空白支架组,骨小梁体积显著增加。Goldner三色染色可见含药支架组中,支架内有大量类骨质的形成,并在硬组织切片中观察到载药支架组有显著的新骨形成。结果表明,负载葫芦素的载药复合支架可促进骨缺损部位的血管新生进而诱导骨修复。综上所述,本研究揭示了低剂量的葫芦素通过激活VEGFR2信号通路促进血管新生,并在体内动物模型中验证了负载葫芦素的复合支架可有效促进血管新生及骨再生。以上结果提示本研究首次报道的低剂量葫芦素的功效在血管新生不足疾病,尤其是骨组织工程血管化等研究领域有潜在的临床应用及转化前景。