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Burkholderia xenovorans LB400联苯双加氧酶的人工进化研究

李俊德  
【摘要】:多氯联苯(PCBs)作为持久性有机污染物,属于典型的海洋污染物。由于多氯联苯在海岸带大量积累,已对生态系统以及人类健康造成了严重的危害与影响。Burkholderia xenovorans LB400是一株高效的多氯联苯降解菌,同时它的生存环境范围广泛,能够在土壤和海水等环境中生存并修复受多氯联苯污染的土壤和海洋。设计、构建和优化LB400工程菌将成为修复海洋环境中多氯联苯污染的有效方式。细菌的多氯联苯代谢途径与细菌的联苯代谢途径相似,启动降解的联苯双加氧酶(BPDO)的底物范围决定了该途径代谢联苯同类物的范围。BPDO的底物范围和区域专一性主要由位于双加氧酶α亚基C末端的氨基酸残基决定,这些氨基酸所在的区域被指定为区域I、II、III和IV。目前,对于联苯双加氧酶的改造主要集中于III区域和IV区域,但是尚未发现在I区域和II区域突变进化BPDO的报道。因此,本研究选择对海洋和海岸带污染严重的PCBs为底物,以降解效率高,底物谱范围广且能适应海洋环境的多氯联苯降解菌株LB400为亲本构建突变体,获得了突变体S283M,p4-S283M和RR41-S283M。通过比较亲本与突变体对联苯及选定的PCBs的催化性能,模拟突变蛋白结构和分子对接等方法探究位于催化中心II区域的Ser283Met突变对联苯双加氧酶催化性质的影响。主要研究内容和结论如下:一、本研究采用两步位点定向突变的方法,将BphAE_(LB400)(野生型),BphAE_(p4)(突变型)和BphAE_(RR41)(突变型)中的283位丝氨酸(Ser)突变为甲硫氨酸(Met)得到三株突变体。成功构建了bph AE基因的表达载体,并转化至Escherichia coli C41(DE3)中,将载有突变基因的Escherichia coli C41(DE3)进行诱导表达,并对其表达产物进行纯化,得到了分子量为51 k Da的Bph A和分子量为22 k Da的Bph E。二、BPDO由三部分组成,测定三组分酶系统的动力学参数是十分困难的。本研究通过检测联苯双加氧酶催化过程中对氧气的消耗,来测定联苯双加氧酶的动力学参数,并建立了氧谱法研究联苯双加氧酶对不同PCBs的特异性。目前已报到的人工改造的BphAEs对联苯的k_(cat)/K_m均低于它们的亲本酶。而在本研究中,相比于亲本酶,突变蛋白BphAE_(S283M)、BphAE_(p4-S283M)和BphAE_(RR41-S283M)对联苯的k_(cat)/K_m值显著提升。同时,目前尚未发现对高氯代联苯的稳态动力学研究,本研究报道了BphAEs对高氯代联苯的稳态动力学研究。结果表明,Ser283Met的突变增强了BphAE对2,3',4,4'-四氯联苯,2,2',6,6'-四氯联苯和2,3',4,4',5-五氯联苯的催化活性。因此,对于与BphAE_(LB400)结构特征相似的联苯双加氧酶,将其283位点进行定点突变是进一步增强其对联苯和高氯代联苯催化活性的有效策略。三、BPDO的区域特异性会影响所形成的产物,这些产物会影响该途径的后续酶对底物的催化降解。本研究比较了野生型BphAE_(LB400)及其变体对2,2'-二氯联苯,2,5-二氯联苯和2,6-二氯联苯的催化反应,并通过GC-TOF-MS分析鉴定代谢产物。以2,2'-二氯联苯为底物时,在所有的突变蛋白中,与它们的亲本酶相比,2,3-二氢-2,3-二羟基-2'-一氯联苯与3,4-二氢-3,4-二羟基-2,2'-二氯联苯的比率明显升高。这表明联苯双加氧酶对2,2'-二氯苯的区域专一性受到Ser283Met突变的影响。以2,6-二氯联苯为底物时,与BphAE_(p4)和BphAE_(RR41)相比,BphAE_(p4-S283M)和BphAE_(RR41-S283M)的两种代谢产物比率发生了显著的逆转,它们都产生了更多的3,4-二羟化代谢产物。此外,本研究通过同源建模和分子对接的方法探究酶与底物的结合方式以及催化区域的空间构象,以解释突变酶的新特性。生化数据表明,Ser283Met的突变改变了催化活性空腔内底物的空间构象,从而改变了其羟基化位点。这一点在分子对接实验中得到了证实。四、Bp AE_(LB400)及其变体对不同类型多氯联苯的催化代谢能力被评估。研究发现BphAE_(S283M)能够高效地转化代谢11种多氯联苯,BphAE_(S283M)相较于其他突变蛋白,具有更广阔的代谢范围和更强的催化性能。这表明BphAE_(S283M)的Met283对联苯双加氧酶的底物选择性有重要的贡献与影响。值得注意的是,已知的联苯双加氧酶对部分PCBs的氧化能力差,尤其是高氯代多氯联苯,但研究发现BphAE_(S283M)和BphAE_(p4-S283M)在催化3-6氯化联苯方面的能力得到了明显的提高。因此,S283M和p4-S283M在修复多氯联苯污染严重的海岸带方面具有潜在的应用价值。综上所述,本研究首次揭示了位于催化中心II区域的突变对联苯双加氧酶催化活性和底物特异性的影响及可能的机制。这对于理解其他Rieske型加氧酶中相应的283位残基功能具有十分重要的意义,同时为如何扩大联苯双加氧酶的底物范围和改变区域特异性的机制研究奠定了一定的理论基础,进而为更有效地修复受PCBs污染严重的海岸带提供了理论依据和技术支持。


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