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魔鬼弧菌L2-2和豚鼠气单胞菌GLB-10对磺胺类抗生素的代谢途径与分子机制研究

王巧宁  
【摘要】:环境中的抗生素及抗性基因污染已经成为21世纪最受关注的新兴污染物之一,其中磺胺类(SAs)抗生素由于使用量大、环境检出频率高而备受关注。细菌由于繁殖速度快、受环境限制小、无二次污染等原因在有机污染物去除领域应用广泛。本文的主要研究内容包括SAs转化/降解菌株的筛选、不同菌株对SAs的转化/降解途径的分析、菌株转化/降解SAs可能的分子机制研究,以及混合菌株对SAs的降解效果与途径研究。具体内容如下:1.SAs类抗生素转化/降解菌株的筛选与鉴定以SAs类抗生素中最常检出的磺胺甲恶唑(SMX)为唯一碳源,以微生物资源丰富的河口水和河口沉积物为菌株来源,筛选能够适应淡水河海水环境的高效转化/降解SMX的菌株,最终分离出3株具有SMX转化/降解能力的单菌株,包括魔鬼弧菌L2-2(Vibrio diabolicus)、豚鼠气单胞菌GLB-10(Aeromonas caviae)和Catellibacterium terrae MMR-2-1,对SMX的降解率分别为27.79%、15.85%和9.96%。2.魔鬼弧菌L2-2对SAs的转化途径和转化效果分析分离到一株能不同程度代谢9种SAs抗生素的海洋细菌——魔鬼弧菌(Vibrio diabolicus,L2-2)。与含有苯胺或对氨基苯磺胺的SAs及其类似物相比,含N-O杂环结构的SAs更容易被菌株L2-2转化为N~4-乙酰化代谢物及其异恶唑环重排异构体。L2-2能同时代谢多种SAs类抗生素,对磺胺噻唑(STZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMT)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲恶唑(SMX)和磺胺恶唑(SIX)5种抗生素6天转化率分别达到29.39±5.63%、24.97±4.45%、79.41±4.05%、64.64±1.71%和32.82±4.46%。此外,对SAs生物转化影响因素进行了研究,发现五种SAs的转化率对不同环境因子的响应略有不同,生物转化最优条件为:SAs初始浓度低于100 mg/L、中性或弱碱性介质、盐度范围10‰-20‰、外加碳源如葡萄糖、蔗糖、甘油等。此外,SAs经L2-2转化后对大肠杆菌的毒性显著降低,说明通过L2-2转化是一种有效的SAs降毒手段。3.魔鬼弧菌L2-2转化SMX可能的分子机制研究通过转录组分析技术研究了L2-2对抑菌浓度(10 mg/L)的SMX的潜在抗性及其生物转化机制,并通过RT-qPCR手段研究了抗性和转化关键基因对环境浓度(0.1-10μg/L)SMX的响应。根据显著富集的KEGG通路分析,SMX可显著影响L-亮氨酸降解、L-异亮氨酸降解和脂肪酸代谢,并最终可能导致细胞内乙酰辅酶A的减少。L2-2对SMX的抗性机制可归纳为:增强膜转运功能、加强抗氧化系统、核糖体保护以及反应调节蛋白和修复蛋白的过表达。芳胺N-乙酰转移酶(NAT)、细胞色素c553(CYC-553)和酰基辅酶A合成酶(ACS)可能是SMX生物转化的关键酶。菌株L2-2暴露于1μg/L的SMX时,SMX羟基化相关基因cyc-553显著上调,而SMX乙酰化相关基因nat未被激活。此外,在10μg/L的SMX胁迫下,菌株L2-2的膜运输和抗氧化活性也被激活。研究还发现,与抗菌浓度相比,L2-2对低浓度SMX的反应略有不同。如,环境浓度的SMX胁迫可能抑制药物外排泵,而在抗菌浓度下药物外排泵明显增强。此外,环境浓度的SMX会使菌株L2-2产生更多的能量来维持正常的生理活动,而抗菌浓度的SMX则会为了生存抑制某些代谢物。该结果为进一步了解细菌对SMX的耐药性和生物转化提供了依据,并为环境抗生素影响的相关研究提供了支持。4.魔鬼弧菌L2-2转化SMX关键酶芳胺N-乙酰转移酶(VdNAT)的克隆表达通过基因组序列分析与RT-qPCR验证,确定魔鬼弧菌L2-2转化SMX关键酶VdNAT的基因全长序列,并在大肠杆菌内克隆表达。克隆VdNAT的大肠杆菌阳性菌株新增加了SMX转化能力,且在添加乙酰辅酶A后,SMX的转化率几乎达到100%,证实了乙酰辅酶A是限制VdNAT转化SMX的关键因素。同时,对VdNAT氨基酸序列进行分析,发现VdNAT与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)NAT同源性最高,同时与人类NAT1和NAT2的同源性也比较高;并发现VdNAT的三维结构会形成一个深而宽的活性位点口袋,这个口袋有利于乙酰辅酶A的结合,这可能是VdNAT具有较高的SMX转化能力的原因。5.豚鼠气单胞菌GLB-10对SMX的降解途径和降解效果分析分离到一株能够降解SMX的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae,GLB-10),对SMX的3日降解率为17.46±0.57%。其降解SMX的主要产物为苯胺(AN)和3-氨基5-甲基异恶唑(3A5MI),同时也检测到了产量较低的对氨基苯磺酰胺(SA)。GLB-10对SMX的可能降解途径是SMX线性末端发生水解,N-C键断裂,生成4-氨基-N-羟基苯磺酰胺(4ANHS),并脱水形成SA,SA或4ANHS通过硫还原4S途径(C-S键断裂)脱硫形成AN。同时SMX发生氨基化侧链的片段化,生成3A5MI。6.混合菌株对SMX的降解途径、降解效果分析及关键蛋白推测富集到的混合菌株具有很强的SMX的降解能力,L2-2和GLB-10均分离自混合菌株。混合菌株对SMX的降解兼具了L2-2和GLB-10的降解特性,主要产物也是AN和3A5MI,N~4乙酰化SMX、羟基化SMX也被检测到,同时也检测到了单菌株降解过程中未产生的乙酰苯胺和对苯二酚。混合菌株对含氮杂环的SAs降解率更高,对未成环的磺胺和磺胺醋酰降解率较低,且不能降解AN。混合菌株可在3日内完全降解250 mg/L的SMX,且降解率基本不受pH影响,但高盐度会降低其对SMX的降解率。通过差异表达蛋白鉴定,发现其外膜蛋白和过氧化物酶表达量显著上调,即通过调节膜蛋白和加强抗氧化防御系统来应对SMX压力;此外,6-羟基烟酸-3-单加氧酶和氨单加氧酶表达量上调,其中6-羟基烟酸-3-单加氧酶可能参与SMX降解,而氨单加氧酶则可能与混合菌株的共代谢有关。混合菌株对实际水样中的SMX同样具有很好的降解效果,且能适应河水、湖水、河口水和海水多种水环境,在环境SAs污染处理中具有很高的应用前景。通过磺胺类抗生素代谢(转化/降解)菌株的筛选、单一和混合菌株对磺胺转化/降解性能、代谢途径及分子机制的研究,扩充了磺胺高效转化/降解菌株的菌种库,为环境磺胺类抗生素污染去除的机理探索和实际应用提供了理论基础和优良菌种。


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