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大丽轮枝菌蛋白激发子纯化、基因克隆与功能分析

王炳楠  
【摘要】:激发子具有激发植物防御反应、诱导提高植物抗病性的功能。本文从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)培养液中分离纯化出一种蛋白激发子,该激发子能引起烟草叶片过敏性反应,诱导烟草植物防卫物质的产生和积累;克隆并获得了激发子基因,成功实现了在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达与纯化,用RT-PCR技术探究了该基因表达产物诱导烟草抗病相关基因的表达。本研究为进一步揭示激发子诱导植物系统获得性抗性及机制研究奠定了基础。 1.利用硫酸铵沉淀、?KTA explorer 10蛋白纯化仪、非变性电泳、割胶电洗脱等方法,从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)发酵液中分离纯化出一种蛋白激发子,经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,相对分子量为17 kD,等电点为4.34,命名为PevD1(Protein elicitor from Verticillium dahliae)。该蛋白激发子能够诱导烟草的过敏反应。 2.蛋白激发子PevD1能激发烟草抗病早期信号事件的发生(叶片H_2O_2的积累,细胞的活性氧爆发,H_2O_2产生,胞外质的碱化,NO的产生和积累);引起防御性物质(胼胝质,酚类和木质素)的产生和积累。诱导烟草叶片的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性提高,PAL活性144 h时达到最大,是对照的3.3倍;在处理120 h时,PPO的含量最高,增幅达到236.8%;POD活性在诱导120 h出现活性高峰,较对照增加204.6.%;同时该激发子诱导烟草过敏性反应过程中,烟草细胞膜通透性增加,细胞发生程序性死亡,细胞发生DNA片段化,并且过敏性反应标记基因hrs203J, hin1被诱导表达。 3.质谱ESI-MS/MS检测并进行de novo从头测序,获得该激发子蛋白3个可靠的肽段序列,在NCBI中肽段比对后发现,该蛋白激发子PevD1是黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)一个假设蛋白,其功能未知。设计特异性引物扩增出pevD1全编码基因序列468 bp,编码155个氨基酸并且含有一个18氨基酸残基的信号肽,理论分子量为16.23 kD。将pevD1构建在pET-28a-c (+)载体上,转入大肠杆菌获得了重组表达蛋白。 4. PevD1可以诱导烟草获得系统获得性抗性(SAR),提高烟草对烟草花叶病毒(TMV)抗性,激发子诱导烟草植株后6天,枯斑抑制率达到53.85%;枯斑大小抑制率达到32.06%。半定量RT-PCR结果显示,激发子诱导烟草叶片抗病相关基因-PR1-a、PR1-b、PDF1.2、NPR1、MAPK上调表达,并表现一定的时序性,说明PevD1诱导烟草抗病相关基因转录水平上调是其诱导系统获得性抗性的重要机制之一。


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