哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系microRNA研究

【摘要】：棉花细胞质雄性不育系在棉花杂种优势利用和棉花育种中具有重大作用和意义。目前由于棉花基因组信息一直以来比较匮乏,细胞质雄性不育机理的研究还很少。miRNA作为真核生物基因表达中的一类负调控因子,广泛存在于植物基因组中,对真核生物基因表达起非常重要的调控作用,可以调控植物的生长发育、器官的形态建成、激素分泌、信号转导以及对外界环境胁迫的应答能力等许多生物学过程。本研究利用solexa测序技术,对棉花细胞质雄性不育系和保持系花粉母细胞时期的小花蕾进行miRNA测序,并通过靶基因预测功能分析,以期获得新的棉花miRNAs和与不育相关的差异miRNAs及其靶基因,取得的主要实验结果如下: 1.通过对不育系和保持系小花蕾miRNAs进行solexa测序,不育系材料ZBA获得的测序序列为9 823 976条,其中miRNAs序列为3 712 462条,去除miRNAs序列中的冗余序列之后,获得miRNAs序列为353 691条,属于145个单一miRNAs序列,包括分属于37个miRNA家族的92个miRNAs和53个候选棉花miRNA序列;保持系材料ZB获得的测序序列为11 449 151条,其中miRNAs序列为4 450 631条,去除miRNAs序列中的冗余序列之后,获得miRNAs序列为274 716条,属于151个单一miRNAs序列,包括分属于38个miRNA家族的90个miNRAs和61个候选棉花miRNA序列。通过测序,在两材料中共发现10个新的棉花miRNAs。 2.生物信息学分析和靶基因预测显示,这些miRNAs靶基因参与的植物生长发育过程主要有能量代谢、物质代谢、生物或非生物环境胁迫应答、激素分泌、信号转导、器官和组织发育、转录调控等。大部分通过靶定转录因子来调控各种生长发育过程。 3.通过统计分析在两材料中共鉴定到42个差异表达的miRNAs,分属于21个miRNA家族。 4.差异表达miRNAs的靶基因预测结果包含一些与花发育和雄配子发育相关的转录因子,有AUXIN RESPONSE FACTOR(ARF)、F-box、泛素(Ubiquitin)、WRKY、APETALA2(AP2)-like、SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL)、MYELOBLASTOSIS(MYB)基因和赤霉素(Gibberellin)等。 5.对与雄配子发育相关的miRNA156进行了荧光定量分析,结果表明miRNA156在材料ZB中的表达量高于在材料ZBA中的表达量,miRNA156很可能通过介导SPL-like而影响雄配子发育。 6.利用SPL-like保守结构域在棉花EST数据库中进行同源搜索,找到16个可能的棉花SPL-like基因。通过Real Time RT-PCR分析,发现10个在两材料中存在明显差异表达,5个在不育系材料ZBA中上调表达,5个在不育系材料ZBA中下调表达。