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二硫键对菌丝霉素抗菌活性的影响及菌丝霉素聚体在毕赤酵母中的表达

王少然  
【摘要】:菌丝霉素(Plectasin)是一种真菌防御素,它对革兰氏阳性细菌具有高效杀伤作用,能有效地抑制肺炎链球菌特别是具有青霉素抗性的肺炎链球菌的生长,对其杀菌速率与万古霉素和青霉素相当,并且对人血红细胞无溶血性,是极具潜力的抗感染药物。为进一步研究二硫键对Plectasin抑菌活性的影响,将本研究室已构建成功的含有Plectasin二硫键突变体的重组表达载体转入毕赤酵母X-33中进行诱导表达。Tricine SDA-PAGE分析发现各突变体均有表达,表达产物经葡聚糖凝胶G-25纯化后,对各个突变体的抑菌活性进行鉴定,比较抑菌圈大小发现,C15-C37二硫键对Plectasin抗菌活性影响较大,突变体(C15/37A)Plectasin和(C4/15/30/37A)Plectasin抑菌活性几乎全部丧失;C19-C39二硫键对Plectasin的抗菌活性影响较小,凡是C19-C39二硫键发生突变的突变体抗菌活性均未丧失,但活性与未突变的Plectasin相比活性都降低。 多聚体串联表达有利于提高多肽的表达量,而且以多聚体形式的多肽更加稳定。本实验尝试在毕赤酵母中融合表达Plectasin多聚体。 首先,在毕赤酵母X-33中融合表达单体Plectasin。在本实验室已优化的Plectasin基因两侧设计了同尾酶XbaⅠ/NheⅠ酶切位点,以便于后续多聚体的构建。在Plectasin多肽和载体蛋白之间分别设计了甲酸或羟胺切割位点,以获得目的蛋白。将设计的单体基因重组到载体pPICZαA上,转入毕赤酵母X-33中进行诱导表达。诱导表达120h后,X-33(pPICZαA/PPD)分泌表达的总蛋白浓度达339μg/mL,X-33(pPICZαA/PN)分泌表达的总蛋白浓度达307μg/mL。表达产物经镍柱纯化、化学试剂切割后,进行抑菌活性鉴定,结果发现切割后获得的单体PPD和PN均可以抑制金黄色葡萄球菌的生长,为下一步多聚体的构建奠定了基础。 在单体表达研究基础上,采用同尾酶构建法构建了Plectasin多聚体。以获得的单体重组载体为基础,对重组载体分别进行双酶切和单酶切,具有相同粘性末端的线性载体和插入片段再连接。如此重复构建了Plectasin二聚体和四聚体。将各多聚体诱导表达,Tricine SDA-PAGE分析发现只有二聚体表达,四聚体没有表达,原因可能是表达条件不理想,需要进行进一步的摸索。 综上,本研究通过对Plectasin二硫键突变体抑菌活性的鉴定和比较发现,二硫键对Plectasin最大抑菌活性的保持有重要作用。同时实现了含甲酸或羟胺切点的Plectasin单体和二聚体的融合表达,为它的制备和应用奠定了基础。


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