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固定化PPO酶制备茶黄素的生化分化离耦联技术研究

王斌  
【摘要】:酶工程技术是现代五大生物工程技术之一,其应用范围很广,主要包括酶的分离和提取、各类酶的开发和生产、固定化技术的研发、酶反应器的研制等几个方面。茶黄素是茶叶加工过程中在茶叶多酚氧化酶、过氧化物酶的催化作用下,将茶鲜叶内含多酚类物质氧化聚合而形成的一类色素物质,几年来的研究发现其比多酚类更具有抗氧化活性等医药保健价值。目前获得茶黄素类物质主要是从红茶中提取,但是红茶中茶黄素含量低且得率非常低,因此限制了茶黄素的医药保健功能开发应用。固定化酶技术近年来发展迅速,对多酚氧化酶进行固定化并用固定化多酚氧化酶制取茶黄素成为制备获得茶黄素的一种可行有效的选择。 本论文利用已有多酚氧化酶固定化技术,对多酚氧化酶进行固定化,制备获得IPPO。根据IPPO特性及茶黄素酶法合成条件,设计了柱填充床反应器实现IPPO连续动态制备茶黄素,结合柱层析分离技术,实现了茶黄素的动态制备与分离的耦联,并对整个耦联工艺进行放大,获得一套规模化的制备茶黄素工艺参数。 自制组装了一套茶黄素连续动态制备的反应器,在此套自制固定化多酚氧化酶填充床反应器中考察了温度、底物流速、氧气流量、反应体系pH四大对茶黄素酶法合成的主要影响因子,结果表明:在柱床体积固定为100mL时筛选出了最适温度为28℃、最佳底物流速2.0mL/min,最优氧气流量50mL/min,最适pH5.7制取茶黄素,茶黄素的形成率为20.99%。 结合柱层析技术,成功实现了茶黄素的IPPO制备与分离的耦联,得到一定含量和酯型比例的茶黄素产品。主要讨论了不同原料对茶黄素制备的影响、不同补料循环方式对茶黄素合成产量的影响。在底物流速11.0mL/min,温度28℃,氧气流量55mL/min,底物为10mg/mL,pH5.0的茶多酚(TP98)1L连续进样反应,在进行30%乙醇洗脱液循环连续制备工艺中,获得含量在80%以上,酯型比例达80%以上的茶黄素产品,得率为11.64%。茶黄素总的得率为20.10%,茶黄素的产量提高了52%。 在以上实验基础上,对茶黄素连续制备与分离耦联工艺进行4倍放大,研究结果表明,合适的放大规模,对茶黄素的合成制备有利,茶黄素产量提高了87%。分段收集不同馏分进行干燥处理,可以得到不同含量和酯型比例茶黄素产品。 总之,通过小规模实验到较大规模的放大实验,实现了茶黄素的固定化多酚氧化酶连续制备与分离的耦联,儿茶素的利用效率得到提高。


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