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紫花苜蓿几丁质酶Class Ⅰ基因的克隆、序列分析及其表达

伊亚莉  
【摘要】:几丁质酶(EC3.2.2.14, Chitinase)简称Chi,分布广泛,以几丁质作为它的天然底物。病原真菌细胞壁的主要成分之一也是几丁质,几丁质酶可以通过降解病原真菌细胞壁中的几丁质,以达到抑制真菌生长的目的,且被分解后的细胞壁碎片还可以诱发寄主植物自身的抗病性增强。此外,有些几丁质酶兼有溶菌酶活性,可以通过破坏病原菌的内部结构使病原菌致死。几丁质酶的这些特性使它成为当前抗病基因工程育种的研究焦点之一。 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为多年生豆科牧草,以产量高、适口性好而闻名。然而,近年来,苜蓿根腐病病害成为制约它发展的一大重要因素。本研究基于这一点考虑,通过向植物中导入外源几丁质酶基因,使其在植物体内表达,从而提高植物体对植物病害的抗性,已达到防治植物病害的目的,为进一步研究将几丁质酶基因导入紫花苜蓿打下理论基础。 主要研究成果如下: 1.本研究依据NCBI中已登录的截形苜蓿(Medicago truncatula)几丁质酶基因的一段EST序列(GenBank登录号:AF167323)设计引物,以“中苜6号”的RNA为模板,利用RACE技术进行cDNA全长克隆,分别扩增出400bp(3’-RACE)和800bp(5’-RACE)的片段; 2.利用生物信息学软件对该序列进行分析得知:该基因全长1132bp,其中含有一个930bp的开放阅读框,编码309个氨基酸。将该基因命名为MsChiⅠ(GenBank登录号:HM224449)。聚类分析显示:它与其他已知植物ClassⅠ类几丁质酶基因具有高度的同源性;功能分析可知:该蛋白为亲水性非跨膜蛋白,属于几丁质酶第19家族; 3.采用限制性内切酶(NcoⅠ和SpeⅠ)双酶切法,构建了植物表达载体MsChi-pCAMBIA1302,并采用冻融法导入农杆菌LBA4404中,用于烟草的转化; 4.通过共培养、筛选、再生得到转基因烟草植株,并进行PCR、RT-PCR的分子检测,说明目的基因已经成功整合到烟草的基因组中; 5.构建了原核表达载体MsChi-pEASY-E1,并用1mmol/L的IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE分析表明:该基因编码的蛋白的分子量在30-40KD之间。


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