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慢病毒载体介导的RNAi抑制牛整联蛋白亚基αv基因表达的研究

张国峰  
【摘要】:受体在病毒与宿主细胞的相互作用过程中起着极为重要的作用。口蹄疫病毒感染宿主细胞的第一步是病毒识别并结合存在于宿主细胞表面的受体,然后在受体的介导下,病毒才能够进入宿主细胞并在其中完成核酸的复制及病毒粒子的装配。整联蛋白是一类由α亚基和β亚基以非共价键结合形成的异源二聚体跨膜糖蛋白,能介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用,在细胞的增殖、分化、移行、生长等许多方面发挥重要作用。该蛋白家族拥有24个蛋白成员,其中,ανβ1、ανβ3、ανβ6、ανβ8是目前公认的FMDV的受体,这四种整联蛋白拥有一个共同的亚基αν。RNAi是由双链RNA介导的序列特异性RNA降解作用。它通过双链RNA的介导,特异性阻抑相关基因的表达,从而导致转录后水平的基因沉默。慢病毒载体是理想的真核细胞基因转移工具,被广泛应用于相关的RNAi研究领域,例如抗病毒研究、遗传性疾病的治疗、基因治疗。利用慢病毒载体稳定转染并整合宿主基因组的特性可以使设计好的RNA干扰片段在目的细胞系中持续表达,达到对靶基因持续干扰的效果。 本实验根据本课题组以前克隆的牛源整联蛋白αv基因(Genban登录号:DQ871215),按照siRNA设计原则,运用在线siRNA设计软件设计3个针对integrin-αv的siRNA靶点序列αν-2270、αν-1716、αν-483和一个siRNA阴性对照si0。运用实时荧光定量PCR技术筛选出高效的干扰片段αν-483,将αν-483的核苷酸序列交由生物公司合成其对应的双链cDNA,双链cDNA通过定向克隆连接至U6进入载体(U6 entry vector),构建出进入载体U6-αν483,U6-αν483与pLenti6/BLOCK-iT~(TM)载体系统中的表达质粒通过LR同源重组反应形成表达载体DEST-αν483。在生长状态良好的20代次之内的293FT细胞中,转染DEST-αν483及包装Mix中的三个包装质粒pLP1,pLP2和pLP/VSVG,72h之后收集慢病毒液,命名为plenti6/αv483。用pk-15进行慢病毒滴度的测定,结果显示plenti6/αv483的滴度为14.2×10~(-6) TU/ml,达到了转染细胞所需的滴度要求。用plenti6/αv483来转染牛肾细胞MDBK,在杀稻瘟菌素的抗性压力之下筛选出了四株单克隆的阳性细胞系,分别为1B8、1F5、2B9、2E6。经核酸水平的实时荧光定量PCR和细胞水平的cell-ELISA及间接免疫荧光实验鉴定,四株细胞系中整联蛋白的表达量均有不同程度的下降,其中1F5细胞株中整联蛋白表达量下调的幅度最大。 本研究筛选了具有高效干扰牛整联蛋白αv亚基基因的siRNA,以此为依据构建了表达具有干扰效果shRNA的慢病毒载体,并运用构建好的慢病毒载体筛选出了整联蛋白表达量下降的稳定转染细胞系。对通过下调病毒受体的表达来降低宿主对病毒敏感性的研究进行了初步探索。


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