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超高压处理对牛乳清蛋白水解及其产物抗氧化活性的影响

盛小波  
【摘要】:超高压技术作为一种非热加工新技术,其在食品加工中的应用越来越受到人们的重视。资料证实,人类的许多疾病与衰老现象、食物的腐败变质及货架期的缩短等均与自由基含量的变化有密切关系。近年的研究发现干酪加工副产物乳清蛋白的水解产物具有一定的抗氧化活性,因而开发乳清蛋白用于生产具有抗氧化功能的活性肽具有重大意义。本研究以商业牛乳清分离蛋白(WPI)为原料,探讨了超高压处理下不同蛋白酶对WPI的水解作用,并对其水解产物的抗氧化活性进行比较分析,在此基础上采用系列分离纯化技术对其抗氧化活性成分进行分析与鉴定,以期为超高压技术用于乳清蛋白抗氧化肽的开发与利用提供理论指导。 采用单因素试验的方法,研究了超高压条件下不同底物浓度、酶与底物比、水解时间和压力强度等因素对Alcalase水解WPI的影响,通过正交试验得出了超高压条件下WPI水解的最优工艺参数:底物浓度5.0%(w/v),酶与底物比5.0%(w/w),水解时间30min及压力强度300MPa,且各因素的主次顺序依次为:水解时间压力强度酶与底物比底物浓度。在最佳水解工艺条件下,WPI的水解度达30.33%。 为了研究超高压处理下WPI的不同蛋白酶水解产物的抗氧化活性,依次采用Pepsin、Chymotrypsin、AS1.398、Alcalase对100~600MPa超高压处理中和超高压处理后的WPI分别进行水解,并采用光化学发光法和邻苯三酚自氧化法对其水解产物的抗氧化活性进行测定。结果显示:与常压下相比,超高压处理有效促进了四种蛋白酶对WPI的水解作用,且其水解产物的抗氧化活性均有了显著提高;400MPa高压处理中的Alcalase水解产物具有最强的抗氧化活性,其水溶性抗氧化能力为1.90μg抗坏血酸/mg,对超氧阴离子自由基的清除能力也达到53.68%。此外,WPI水解产物的表面疏水活性随其水解度的增加而显著降低,二者之间呈良好的负相关。 采用截留分子量为10kDa和3kDa的超滤离心管对具有最强抗氧化活性的Alcalase水解产物进行超滤离心分离,发现该乳清蛋白肽中分子量3kDa的组分Ⅲ的抗氧化活性较强,其对超氧阴离子自由基的清除能力达75.92%;氨基酸组成分析的结果表明组分Ⅲ的Tyr、Lys及总疏水性氨基酸的含量显著高于其它组分。进一步采用Sephadex G-25对组分Ⅲ进行凝胶过滤层析,发现分子量范围在589~1349Da的低分子肽对其抗氧化活性的贡献最大。MALDI-TOF在m/z 500~3000范围对该低分子肽组分检测发现了5个小于1000Da的质谱峰,即:617.14Da,673.11Da,744.02Da,902.75Da和929.42Da,以及一个分子量为1242.08Da含量相对较低的质谱峰信号,nano-LC/MS/MS鉴定的结果证实其中的2种肽(Glu-Gln-Leu-Thr-Lys和Glu-Leu-Lys-Asp-Leu-Lys)源于α-La,其余4种肽(Gly-Leu-Asp-Ile-Gln-Lys、Thr-Lys-Ile-Pro-Ala-Val-Phe-Lys、Lys-Ile-Ile-Ala-Glu-Lys-Thr- Lys和Thr-Pro-Glu-Val-Asp-Asp-Glu-Ala-Leu-Glu-Lys)来源于β-Lg。


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