苜蓿盲蝽两种气味结合蛋白功能的初步研究

【摘要】：苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus Goeze是一种重要的农业害虫,常常在我国黄河流域棉区和西北内陆棉区对棉花造成危害。另外,苜蓿盲蝽的食性很杂,还能够为害黎科、豆科、葫芦科、亚麻科等作物和牧草等。在昆虫有效感受外界信息物质的过程中,昆虫的嗅觉系统发挥了重要的作用,能够保证昆虫准确觅食、寻找配偶和产卵场所等。昆虫的嗅觉识别过程复杂,包括气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)、信息素结合蛋白(PBPs)、气味降解酶(ODEs)以及气味受体(ORs)等多种蛋白参与。其中昆虫气味结合蛋白是目前研究的一个热点。以气味结合蛋白基因为靶标,对昆虫嗅觉行为进行调控是害虫治理的一条潜在有效途径。本文以苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP4和AlinOBP8为研究对象对其功能进行了初步研究,主要取得以下主要结果。 利用同源建模的方式对苜蓿盲蝽AlinOBP4和AlinOBP8的三维结构以及识别气味分子的结合位点进行了预测。结果表明,这两个气味结合蛋白的结合口袋主要是由疏水性氨基酸构成,但在结合口袋的内部也存在亲水性的氨基酸。模型显示,AlinOBP8比AlinOBP4结合口袋更大,同时口袋内部的疏水性的氨基酸也更多。据此推测AlinOBP8能够识别结合更多的气味分子,而AlinOBP4可能对气味的识别更具有专一性。气味结合蛋白的疏水性氨基酸可能与疏水性的气味分子的结合作用相关,亲水性的氨基酸残基则可与气味分子的官能团形成氢键。 将苜蓿盲蝽触角中特异性表达的AlinOBP8基因进行了原核表达,纯化的重组蛋白与85种气味分子的进行荧光配体结合实验。结果表明,与AlinOBP8结合比较强烈的气味分子多为绿叶气味物质。其中结合能力最强的几种气味分子包括月桂酸乙酯、乙酸叶醇酯、法尼醇、异癸醇和(E)-2-己烯醛,结合常数分别为0.462μmol/L、0.650μmol/L、0.665μmol/L、0.784μmol/L和1.739μmol/L。而一些报道的盲蝽科性信息素类似物与AlinOBP8的反应并不强烈,丁酸己酯的结合常数为3.164μmol/L,丁酸反-2-乙烯酯的结合常数为3.274μmol/L,丁酸丁酯的结合常数为3.382μmol/L。据此,推测AlinOBP8可能是一种普通气味结合蛋白。 采用EAG方法测定了苜蓿盲蝽雌/雄成虫触角对不同气味分子电生理反应。结果发现,EAG的相对值较大的多为醛类,如(E)-2-己烯醛、3,4-二甲基苯甲醛、戊醛、辛醛等。在反应值较大的前20个标样中,包括6种醛类、5种酯类、3种酮类、3种醇类、3种烷烃。其中包括7种棉花挥发物以及已报道的3种性信息素类似物成分。同时在EAG反应中雌雄虫反应差异极显著的8种气味分子中包括3,4-二甲基苯甲醛、辛醛、苯甲醛、十一烷、2-己醇、辛烷、十二醛、水杨酸甲酯。 使用显微注射法对苜蓿盲蝽的气味结合蛋白基因AlinOBP4成功进行了RNA干扰。结果表明,显微注射48小时后干扰后的昆虫相较于未干扰的昆虫对于性信息素类似物的EAG反应明显下降,并且雄虫比雌虫下降的更多。RT-PCR检测发现,注射siRNA的苜蓿盲蝽的AlinOBP4的mRNA的表达量被降低至极低水平。采用实时荧光定量PCR (Real time qPCR)检测结果也证实AlinOBP4基因被有效沉默。 解析昆虫气味结合蛋白在嗅觉过程中的功能,以OBPs为潜在作用靶标,干扰害虫的嗅觉感知来有效控制昆虫的行为,是一种治理害虫的有效策略。本研究结果有助于阐明苜蓿盲蝽识别气味物质的分子基础,可以帮助我们设计新型引诱剂或驱避剂,为开创害虫治理新途径提供理论基础。