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低磷胁迫响应microRNA及靶基因的克隆和大豆遗传转化研究

孙佃臣  
【摘要】:大豆是世界上最重要的油料作物之一。土壤中总磷含量很高,但大部分不能被作物吸收利用,此外磷肥的大量施用必定加剧环境污染。提高大豆对低磷胁迫的耐受性,对保护环境及大豆的高产、稳产具有重要的现实意义。运用基因工程的方法挖掘相关基因,并通过遗传转化将目的基因导入大豆,是改良大豆对低磷胁迫耐受性的一个重要途径。 近年来,microRNA及其靶基因的作用机理成为研究的热点。microRNA是一类长21-25nt的内源非编码RNA,它们通过在转录或转录后水平抑制靶基因的表达。microRNA399和microRNA398是两个与拟南芥耐低磷胁迫相关的microRNA,在低磷条件下,能够较快地做出响应。本实验构建了拟南芥pre-microRNA399b和大豆microRNA398a靶基因GmSODC两个植物表达载体,通过发根农杆菌诱导转化根验证这些基因的功能,通过根癌农杆菌介导转化大豆子叶节,获得转基因植株。主要研究结果如下: 1、通过PCR方法分别从拟南芥和大豆中扩增到了两个目的基因(microRNA399b和GmSODC),采用LIC(Ligation-Independent cloning)法将目的基因连接到双元植物表达载体pJG045上,将验证后的质粒采用冻融法导入到农杆菌EHA105中,构建成两个植物表达载体。 2、将目的基因分别连接到带有GFP的植物表达载体pCX-DG上,采用冻融法导入到发根农杆菌K599中,以大豆子叶节为受体,进行了两个目的基因功能的初步验证。通过低磷水培实验,GmSODC对大豆耐低磷胁迫能力有一定的改善,microRNA399b作用不明显。 3、通过嫁接与农杆菌介导的子叶节法相结合,经普通PCR及荧光定量PCR验证,得到转化microRNA399b的T0代植株1株,得到转化GmSODC的T0代植株13株,T1代植株4株。


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