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己烯雌酚和双烯雌酚单克隆抗体的制备及ELISA方法的研究

邓省亮  
【摘要】:己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)和双烯雌酚(Dienestrol,DIEN)是人工合成的非甾体雌激素,由于具有促进蛋白沉积、提高动物日增重和减少脂肪合成等作用,曾经一度作为促生长剂广泛应用于畜牧养殖业。随着其致畸致癌等毒副作用广泛被人们所认识,许多国家和地区先后颁布禁令,禁止其应用于畜牧生产。由于受到经济利益的驱使,违法使用的现象依然存在。为了有效地监控动物性食品中的DES和DIEN残留,建立一种简单、快速、准确、灵敏的检测方法势在必行。本研究旨在分别制备抗DES和抗DIEN的单克隆抗体,建立DES和DIEN残留检测的ELISA方法。 1.分别活化DES和DIEN,针对DES合成了3种半抗原:己烯雌酚-单羧基丙基醚(DES-CP)、己烯雌酚-半琥珀酸(DES-HS)和己烯雌酚-单羧基甲基醚(DES-CM);其中,DES-CP通过活泼酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原,DES-CP、DES-HS和DES-CM与卵清蛋白(OVA)偶联作为包被原。针对DIEN合成了2种半抗原:双烯雌酚-单羧基丙基醚(DIEN-CP)和双烯雌酚-半琥珀酸(DIEN-HS),其中,DIEN-CP与BSA偶联作为免疫原,DIEN-HS与OVA偶联作为包被原。抗原经紫外扫描图谱鉴定,DES和DIEN分别与载体蛋白偶联成功。免疫原经基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定,DES和DIEN与BSA偶联比分别为12:1和11:1。 2.为了研究间隔臂对ELISA灵敏度的影响,设计了上述3种不同空间结构间隔臂的包被原(DES-CA-OVA、DES-CP-OVA、DES-HS-OVA)测定抗血清。将DES免疫原免疫新西兰白兔,获得了抗DES的多克隆抗体。结果表明4个碳链间隔臂异源结构的包被原(DES-HS-OVA)建立ELISA的灵敏度最高。以此包被原建立间接竞争ELISA标准曲线,DES在1~30 ng/ml呈线性关系,IC50为7.0 ng/ml。同时,抗DES多抗成功的获得也为制备单克隆抗体打下了坚实的基础。 3.为了制备DES和DIEN单克隆抗体,将DES和DIEN免疫原免疫BALB/c小鼠,经融合、选择性培养、筛选、克隆等步骤,获得了3株稳定分泌抗DES抗体的细胞株,分别命名为3B9、8F10和9C1;2株稳定分泌抗DIEN抗体的细胞株,分别命名为7H8和10D10。将细胞注入BABL/c小鼠腹腔生产腹水,硫酸胺纯化,SDS-PAGE电泳鉴定。间接ELISA测定抗DES和DIEN单克隆抗体效价都达到1: 1.0×106。单抗亚类试剂盒测定,分泌的单抗都属于IgG1, Kappa型。 4.以抗DES和抗DIEN单克隆抗体为基础,分别优化了包被原和抗体工作浓度、包被条件、封闭时间、抗体反应时间、缓冲液pH、离子强度等条件,建立了DES和DIEN间接竞争ELISA方法,其中DES在0.3~3 ng/ml呈线性关系,IC_(50)为1.0 ng/ml,检测限(LOD)为0.065 ng/ml,定量限(LOQ)为0.15 ng/ml,与己烷雌酚(HEX)和DIEN的交叉反应为7.7%和1.3%,与17β-雌二醇无交叉反应。DIEN在1~30 ng/ml呈线性关系,IC50为5.4 ng/ml,LOD为0.16 ng/ml,LOQ为0.24 ng/ml,与HEX、DIEN和17β-雌二醇均无交叉反应。 5.将DES和DIEN分别添加至鸡肉中进行回收率测定,结果显示DES回收率为71%~107%,DIEN的回收率为62%~64%。以此方法测定了随机采集的16份鸡肉样本,结果均未发现有DES和DIEN超标。为了进一步验证方法的可靠性,与进口试剂盒进行了比对试验,结果显示此法与进口试剂盒的回收率和变异系数相近;进口试剂盒测定的16份随机鸡肉样品,结果显示全部呈阴性。目前,我国国家标准中对DES和DIEN残留检测的确证方法(LC-MS/MS)的检测限为1μg/kg,表明建立的DES和DIEN的ELISA方法能满足动物性食品残留检测的要求。


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