烟草抗病基因筛选及其高通量RNAi载体库的构建

【摘要】：烟草是我国重要的经济作物之一,而烟草病害是烟草生产上的重要问题,因此发掘抗病基因用于烟草遗传育种的研究,早在上世纪20年代已经开始。早期烟草抗病基因的筛选大多是通过个体水平上的抗性鉴定进行的,随着图位克隆尤其是植物基因组测序技术的发展,越来越多植物的抗病基因可以通过同源比对进行筛选鉴定。同时,目前RNA测序(RNA-seq)已成为进行基因表达和转录组分析的重要手段。本研究以普通烟草种红花大金元(N.tabacum,2n=4x=48)、野生种林烟草(N.sylvestris,2n=2x=24)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis, 2n=2x=24)、耳状烟草(N.otophora,2n=2x=24)等四个烟草种为供试材料,对开花时期的主要器官(根、茎、叶和花)进行了转录组测序与分析。对绒毛状烟草全基因组中NBS类基因进行了分析,明确了烟草NBS类抗病相关基因的数量及其类型、分布特征和系统发育学关系等。根据绒毛状烟草基因组抗病相关R基因的生物信息分析结果,选取其中的重要基因批量设计引物,利用GATEWAY表达载体构建方法,构建了高通量的烟草RNAi载体库。为进一步开展烟草抗病相关R基因的克隆及其功能的鉴定验证奠定了基础。主要研究结果如下: 1.在转录水平上绒毛状烟草不同组织基因表达存在明显差异 本研究首次采用转录组测序方法,对4个烟草种的4个器官进行了表达谱分析。结果发现,以绒毛状烟草基因组和基因集为参考,绒毛状烟草转录组数据分别有大约74%和59%的reads可以比对到基因组和基因区上,其中分别有43%和35%的reads能完全进行匹配。共有28 144个基因有转录组数据支持,数量占全部基因集的83.5%。通过转录组数据对预测基因进行了结构优化,并发现了很多新的转录本和可变剪切形式。 采用RPKM法定量每个基因的表达水平,结果表明不同组织中的组织特异表达基因的数量差异很大,至少有1 642个基因存在组织特异性表达。其中,组织特异表达基因分布较多的器官是花,基因达到1 478个;在根、茎和叶组织中,特异表达的基因分别有866、179和165个。 2.从绒毛状烟草基因集中筛选出282个含NBS结构的抗病基因 根据绒毛状烟草测序结果,通过hmmer软件在绒毛状烟草基因集中预测得到282个含NBS结构的抗病基因。 对获得的所有NBS类型R基因进行转录组数据的表达谱比较,结果表明在282个NBS类基因中共有154个基因具有转录组表达数据支持。其中,根、茎、叶和花中分别有145、134、129和132个基因有表达数据。有10多个基因在四个种的组织中都呈现高表达,说明这类R基因可能具有广谱抗性。 此外,在林烟草、耳状烟草和普通烟草转录组数据中分别鉴定出220、247、320个序列含有NBS结构域。 3.构建了绒毛状烟草NBS类抗病基因的系统进化树 NBS类抗病基因的系统发生分析表明,进化树除了少数几个小的分支外,簇状大的分枝较为明显,基本上按照结构类别形成较大的簇状分枝,成簇基因在进化树末端聚在一起,可能是近期通过复制产生的,表现出更近的亲缘关系;也有部分基因呈单独分支存在,与类别存在差异,表明烟草抗病基因发生了较为复杂的进化过程。 在绒毛状烟草基因组鉴定出的282个NBS类型抗病基因中,136个基因在染色体上的物理位置相近或相邻即形成基因簇。在形成的54个基因簇中,每个基因簇平均包含2.5个基因,最大的一个基因簇包含6个基因。共鉴定了11个hm同源基因,说明hm是一个多基因家族。 4.利用GATEWAY表达载体构建法构建了高通量的烟草RNAi载体库 在绒毛状烟草基因组抗病基因鉴定的基础上,根据已报道的抗病基因种类和烟草EST数据以及转录组数据的支持,我们从这些抗病基因中筛选出比较完整和可靠的候选基因共186个进行功能验证。 利用GATEWAY表达载体构建方法,构建了高通量的烟草RNAi载体库。把186条R基因干扰片段的全部或部分连接到入门载体pDONR201中,用转化的克隆数评价烟草抗病R基因RNAi文库的容量,经计数分析,每微升初始库含有阳性克隆4.66×10~4 cfu,在200μL抗病R基因RNAi载体初始库中共有阳性克隆9.32×10~6 cfu,表明构建的表达载体库质量较高,为大规模研究R基因的功能和利用R基因打下了良好的基础。