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小麦DREB/ERF转录因子相互作用蛋白质的筛选与验证

邱志刚  
【摘要】:植物在干旱、高盐和低温的条伯下,能够感受胁迫信号,并传递给转录因子,并最终调控胁迫相关基因的表达,在生理生化水平上做出抗逆反应。转录因子在转录水平起到至关重要的调控作用。大量实验表明,DREB/ERF转录因子广泛存在于拟南芥、烟草、水稻等植物中,能够特异调控下游逆境庆答基因的表达。DREB/ERF转录因子基因能够明显提高植物的抗逆性。 转录因子在调控过程中与其它蛋白质发生相互作用:如翻译后的磷酸化,形成转录复合体等。Ham等人采用酵母双杂交的方法筛选到了Tsil的互作蛋白Tsip1。实验表明,Tsil与Tsip1相互作用确实加强了对下游抗逆基因的调控。转两个互作基因的植株与转单个基因的植株相比明显提高了烟草的抗逆性,并且减少了转基因矮化的负面效应。因此对作物抗逆相关转录因子互作蛋白质的研究有利于更好的了解转录调控机理,为转基因作物改良做一些基础工作。 本文采用酵母双杂交的方法,以小麦的W17和DREB3为诱饵,筛选互作蛋白并验证。得到如下结果: 1.总cDNA的合成:采用Clontech的SMART方法合成总cDNA,电泳检测结果在200bp到2 Kb左右出现一条smear带,主带集中在700 bp左右。 2.共转化的方法筛选酵母文库:将W17/DREB3/总cDNA和AD质粒共同转化酵母细胞。转化效率和AD质粒的插入片段的大小表明酵母文库的质量较理想。阳性克隆的测序结果汇总分类,将其分为两组:翻译后修饰类,转录调控复合体类。 3.蛋白的互作验证:将诱饵蛋白质粒和候选蛋白质粒转化酵母细胞,在营养缺陷型SD/-Trp/-Leu平板上培养,挑取单菌落摇菌,吸取1μL点至SD/-Trp/-Leu平板上。酵母在SD/-Trp/-Leu平板上生长证明互作组合蛋白均转化入酵母细胞中。再吸取1μL菌液点在营养缺陷型SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal平板上培养,结果显示HSP90和PPR的菌落能正常生长且菌落显蓝色。这一结果初步证实HSP90和PPR蛋白与W17发生了相互作用。 4.STK激酶全长的获得及结构表达特性分析:采用EST拼接及TaKaKa 5'RACE的方法得到一条丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的全长序列。氨基酸同源性分析表明蛋白质的N端含有一个由200多个氨基酸残基组成的丝苏激酶催化保守域,C端含有一个ATP结合位点。通过RT-PCR的方法对STK激酶的表达特性进行分析,结果表明:在冷,旱,盐及激素的处理条件下,STK激酶基因有表达趋势,说明STK激酶基因有可能参与逆境胁迫的调控途径。STK激酶基因的蛋白水平调控及与W17的互作模式有待于进一步实验验证。 5.小麦TaBS1转录因子基因的原核表达及Western blot检测:转录因子在提高植物抗性中起着重要的作用。本实验克隆得到小麦中一个具有DUF822保守域的转录因子基因TaBS1。为了进一步研究该转录因子在参与植物胁迫信号调控中的作用以及蛋白本身的结构、功能和活性等,将TaBS1基因构建到原核表达载体pET-28a(+)上。在终浓度为1 mmol/L IPTG诱导2h的条件下,得到融合蛋白His-TaBS1;并用Western blot确定所表达的蛋白确实为融合蛋白His-TaBS1。本研究为进一步研究该蛋白的功能和结构特征奠定了基础。


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