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棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征及侧翼序列分析

徐荣旗  
【摘要】:棉花黄萎病(Verticllium wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae kleb)引起的土传维管束病害,每年在世界范围内给棉花生产造成重大损失。多年来,国内外学者对大丽轮枝菌的致病机理进行了大量研究,但有关其致病的分子机制研究却非常滞后。本研究以我国落叶型棉花黄萎病菌VD991为野生型菌株,通过农杆菌介导的遗传转化,获得了大量大丽轮枝菌的T-DNA插入突变体,并进行了转化条件优化、突变体表型鉴定和插入位点侧翼序列的分析等研究,建立了大丽轮枝菌T-DNA插入突变和致病相关基因筛选研究的技术平台,为开展黄萎病菌致病的分子机制研究奠定了基础。 在Mullins建立的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)转化方法基础上进一步优化了介导黄萎病菌T-DNA插入突变的条件,获得插入突变体2628个。经过分子验证和连续继代培养,证明这些突变体的抗性遗传稳定。部分突变体的表型鉴定结果表明:(1)VD991在正常恒温培养时并不产生微菌核,突变后部分突变体由菌丝型变成了菌核型,在培养5-7天开始产生大量微菌核,这部分突变体约占7.3%左右;(2)无论在MM还是PDA固体培养基上,突变体的生长速度普遍小于野生型菌株。在摇瓶培养条件下,大部分突变体产孢量的高峰在培养后第5-6天;菌丝型突变体的产孢能力和野生型接近或略低,而大部分菌核型突变体的产孢能力都高于野生型VD991,最高的达到VD991的4.9倍;(3)胞外酶检测结果表明:在平板培养时,VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶,并能在以几丁质为惟一碳源的查比克培养基上生长。筛选出不能在MM培养基上正常生长的营养缺陷型突变体8个,不能利用脱脂奶粉的突变体3个,不能利用可溶性淀粉的突变体5个,果胶酶分泌降低的突变体7个;(4)利用棉花幼苗孢子悬浮液茎部穿刺和灌根接种方法,对部分突变体的致病性进行了鉴定,筛选出致病力减弱的突变体6个。 采用hiTAIL-PCR的方法,获得了30个突变体T-DNA插入位点的右侧序列,与公布的大丽轮枝菌VDLs.17和黑白轮枝菌VaMs.102基因组序列比对结果表明:(1)侧翼序列与大丽轮枝菌VDLS.17DNA序列的一致性,均在95-100%之间,与黑白轮枝菌VaMs.102的一致性较低,为87-94%,说明VDLs.17基因组可以用作VD991功能基因研究的参考序列;(2)VD991和VDLs.17序列之间,除存在大量的单碱基差异和缺口外,有少数基因序列间表现出片段的插入和重新排序;(3)有7个突变体T-DNA插在基因编码区,13个突变体插入在基因编码序列上游500bp以内,这可能直接影响了下游基因的表达;(4)根据插入位置和表型分析,5个突变体T-DNA插入位点下游基因可以作为功能基因研究的候选基因;(5)突变体H20侧翼序列在大丽轮枝菌VDLs.17中未找到匹配序列,而在黑白轮枝菌VaMs.102基因组中存在一致性88%的同源序列,这在进化上是如何形成的值得进一步研究;(6)将30个突变体的T-DNA插入位置进行对比,发现它们插入位点不同,并广泛分布在所有8个染色体上,进一步证明了T-DNA插入事件的随机性。


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