华北大黑鳃金龟气味结合蛋白特异结合位点探讨

【摘要】：昆虫在复杂多变的环境中能够准确而迅速地对配偶及寄主植物进行定位及选择，主要是由于昆虫与昆虫之间，昆虫与植物之间存在着复杂的信息交流，传递这些信息的气味化合物就是昆虫与昆虫或者昆虫与植物之间的化学语言，与此相适应，昆虫在长期进化过程中形成的对气味物质高度特化的感觉器官及感应机制，能识别环境中特异的化学气味分子。触角就是昆虫重要的嗅觉器官，对气味分子具有识别和鉴定的作用。华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann是我国重要的地下害虫之一，由于此类幼虫（蛴螬）为害隐蔽性、为害期漫长而防治困难。目前通过对成虫的取食、交配和产卵等行为的干扰达到防治目的的新措施取得了较大进展，探讨调控成虫寻找寄主植物或配偶的行为达到控制幼虫为害目标的相关研究已受到高度重视。本文利用生物信息学、分子生物学及荧光结合等技术对华北大黑鳃金龟嗅觉系统气味结合蛋白的结合机制进行研究探讨，明确其结合气味物质的功能位点，为探索昆虫嗅觉机制提供新的方法和途径。主要研究成果如下： （1）对GenBank里已知序列华北大黑鳃金龟OBP1和OBP2利用生物信息学工具分析两者的基本性质，包括等电点、信号肽、跨膜区及20种氨基酸含量等。根据两者的氨基酸序列对其进行同源建模，结果显示，两种蛋白的三维结构都是由6个α螺旋构成，存在3对二硫键，起着稳定蛋白质结构的作用，有一个由5个α螺旋形成的疏水口袋。不同点是由于氨基酸序列组成不同，疏水口袋的组成不同，表现在氨基酸残基的数目和种类上。 （2）在已经模拟建立的HoblOBP1和HoblOBP2的三维结构的基础上，将两种蛋白与苯甲酸己酯进行分子对接，根据对接结果，分别预测两种蛋白结合气味分子起关键作用的功能位点。分析蛋白内部及蛋白与气味化合物之间的结合特性发现，在HoblOBP1和HoblOBP2蛋白C末端的α6螺旋上，均分别形成两对分子内氢键可以像锁一样锁住苯甲酸己酯。并且两种蛋白与苯甲酸己酯都是通过疏水作用和范德华力来相互作用的。通过同源建模和分子对接对华北大黑鳃金龟气味结合蛋白OBP1和OBP2结合模式的研究，预测OBP1的结合位点是MET48、ILE80和TYR111，OBP2的结合位点是LEU73、THR54与VAL137。 （3）利用快速定点突变技术，对已经预测的HoblOBP1结合气味分子几个可能的关键结合位点进行氨基酸替代，即将Met48、Ile80和Tyr111均成功突变成为丙氨酸（Ala），随之将三个突变体及未突变基因的表达载体转化大肠杆菌Resotta（DE3）感受态细胞，经0.7mM IPTG诱导后成功表达，且大小一致。将目的蛋白大量表达，超声破碎后纯化上清，透析除盐后超滤浓缩，切除带His标签的载体。 （4）选择苯甲酸己酯、β-紫罗兰酮、肉桂醛、月桂烯四种气味物质与四种蛋白进行荧光结合验证试验，结果表明，酪氨酸TYR111是华北大黑鳃金龟气味结合蛋白OBP1的关键结合位点，说明在C末端，TYR形成的两个分子内氢键是OBP1功能的关键。ILE80是OBP1结合气味物质的其中一个结合位点但可能不是关键位点，明确OBP1与气味配体之间的相互作用力除了通过疏水作用之外还有范德华力而不是氢键。M48A并不是OBP1结合配体的位点，可能它只是影响苯甲酸己酯在蛋白口袋内的伸展方式。