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侧孢短芽孢杆菌A60抗菌肽分离纯化与功能分析

赵璟  
【摘要】:抗菌肽是一类广泛存在于生物体内的小分子多肽,对病原细菌、真菌、病毒甚至肿瘤细胞都具有明显的抑制及杀灭功能。抗菌肽按照合成途径可以分为两大类,第一类是由非核糖体途径合成的环肽、伪肽等次级代谢产物,其主要由细菌合成;第二类是由核糖体途径合成的抗菌肽,其不仅来源于细菌同时也广泛存在于动物、植物和微生物中。大多数抗菌肽是线状或者环状的,同时具有亲水与疏水的性质,其不仅可以通过形成跨膜孔道裂解细胞,还可以同细胞内的靶标分子结合调节转录与翻译。 细菌产生的抗菌肽是一类重要的抗菌物质,由于其抗菌谱广、对环境友好、对哺乳动物无害等优点受到了广泛的关注。侧孢短芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质,包括伴孢晶体、胞外蛋白酶类、以及抗菌脂肽。近些年发现侧孢短芽孢杆菌也能分泌一种线性的短肽,具有很强的抗菌特性,如Loloatin A。 为了进一步挖掘新的抗菌肽资源,本文以侧孢短芽孢杆菌A60菌株为研究材料,从其发酵液中分离纯化出一种新的抗菌肽BL-A60,该抗菌肽对多种植物病原细菌和植物病原真菌均有较好的抑制及杀灭作用。本研究为培育农作物抗病新品种提供了宝贵的基因资源,也为新型生物农药的开发与研究奠定了基础。本研究主要研究结果如下: 1、筛选出一株高活性生防菌株。从芒果地土壤中分离出65个菌株,又从其中筛选得到一株抗菌活性高的菌株A60,研究其生长特性,确定其代谢产物具有很强的抑菌活性。 2、通过16s rDNA鉴定,确定了A60菌株的分类地位。构建系统发育树,分析确定了该菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)(该菌种已经于2012年1月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101,登记入册编号CGMCC No:5694)。 3、确定了反应抗菌肽活性的指示真菌辣椒疫霉。以侧孢短芽孢杆菌培养液粗提组分对不同的真菌菌丝生长的抑制率为标准,从辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. niveum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)等三个植物病原真菌中筛选并确定了辣椒疫霉为测定抗菌肽抗菌活性的指示菌。 4、建立分离纯化抗菌肽的技术路线。利用硫酸铵沉淀、阳离子交换层析、薄层层析、反向高效液相层析等技术分离纯化抗菌肽,纯化出的抗菌肽纯度达到95%以上。 5、抗菌肽理化性质研究。侧孢短芽孢杆菌抗菌肽BL-A60具有耐热、酶稳定、pH稳定、既能溶于水又能溶于有机溶剂等性质,为其以后开发利用奠定了基础。 6、利用二级质谱以及三级质谱确定抗菌肽一级结构。利用LC-MS/MS以及MS3对抗菌肽进行质谱分析,手动拼接测序获得一段分子量为1602.0469Da的抗菌肽L-Y-K-L-V-K-V-V-L-N-M,其中该氨基酸序列的N端上还连接有-(CH2)3N(CH3)2,C端上还连接有细交链孢菌酮酸衍生物。序列对比未发现同源序列,可能为首次发现新抗菌肽(SPIN ID:SPIN000006235)。 7、生物信息学分析显示该抗菌肽为典型抗菌肽结构。分析显示该抗菌肽为阳离子抗菌肽,二级结构为α螺旋结构,并利用生物信息软件对抗菌肽进行三级结构预测及分析,为后续多肽的合成及药物研发提供了理论基础。 8、抗菌肽BL-A60对植物病原细菌、真菌具有抑制作用。抗菌肽对革兰氏阴性菌番茄疮痂病菌(XanthomonasCampestris pv.Vesicatoria),革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及植物病原真菌辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)等具有抑制作用。 9、抗菌肽BL-A60对辣椒疫酶无性生活史菌有抑制作用。此抗菌肽抑制辣椒疫霉菌菌丝生长,影响其孢子囊产生,并且影响其休止孢萌发。另外还研究了辣椒疫霉菌对游动孢子致病性的影响。


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