瓶霉属Phialophora spp.来源的纤维素酶和半纤维素酶的基因克隆与表达

【摘要】：随着化石燃料的短缺和对环境保护的日益重视,人们一直在努力寻找其他替代能源。作为自然界第一大再生资源的木质纤维素,因其可用于生产生物能源,成为了人们研究的热点。在木质纤维素降解过程中,一般先要用稀酸进行热处理来提高转化效率,然后再进行酶降解以获得终产物葡萄糖,所以在生物质转化中嗜热、嗜酸且稳定性好的纤维素降解酶就显得至关重要。 本研究从酸性矿液废水中分离到两株可以降解木质纤维素的真菌,G5和P13。通过形态和ITS序列分析鉴定为瓶霉Phialophora。对高产纤维素酶活的菌株G5进行了产酶情况的初步分析,在玉米芯或微晶纤维素作为唯一碳源诱导下,该菌株具有较好的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、p-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的生产能力。所产酶的最适pH在4.0-5.0之间,最适温度除木聚糖酶(50℃)外都高于60℃且在50℃有很好的稳定性。与商业酶Accellerasc1500(Genencor)比较,菌株G5的发酵液对纯纤维素和天然底物的降解能力分别可以达到商业酶的60%和80%。 通过简并PCR和TAIL-PCR的方法从菌株G5中克隆到一个第5家族的内切葡聚糖酶编码基因egG5,一个第45家族的内切葡聚糖酶基因egGH45,一个第6家族的外切纤维素酶基因cbh6A,和一个第1家族的葡萄糖苷酶基因bglGH1。这些基因都具有一定的新颖性,其推测氨基酸序列与其它真菌来源的已知蛋白序列一致性为67-85%。经毕赤酵母异源表达纯化后,这些基因重组蛋白的酶学性质得以确定。重组EgG5最适pH为4.0-5.0,最适温度为70℃,在80℃还有70%以上酶活,且具有良好的热稳定性(65℃处理12h剩余52.5%酶活)。EgG5模拟三维结构分析表明其催化位点附近带负电荷且含有特殊的β-折叠片结构,该结构可能与其嗜酸和热稳定性有关。为了验证其功能,构建了两个突变体EgG5-Mut(将β-折叠片突变成环状结构,并以园二色光谱测定二级结构)和EgG5-CBM(去掉CBM区),同时进行表达和性质分析。两个突变体和EgG5有相似的最适pH和温度,但是pH稳定性分别是pH2.0-10.0和pH2.0-7.0。它们的热稳定性改变明显,EgG5-Mut的热稳定性变差,65℃处理12h,剩余13.4%酶活；EgG5-CBM则变得更加稳定,65℃处理12h,剩余94.9%酶活,在80℃处理30min后仍保留15.5%酶活,同时其比活更高(711.6U/mg v.s.60.3U/mg)。重组EgGH45和CBH6A的最适pH分别是6.0和7.0,在pH5.0-8.0和pH5.5-8.0还有80%的相对酶活。最适温度分别是60℃和65℃,在pH2.0-11.0和70℃以下温度稳定(保持80%以上的酶活)。重组BglGH1最适pH5.5-6.0,最适温度50℃,是一个可降解芳香族β-葡萄糖苷和纤维寡糖的广谱葡萄糖苷酶。 菌株G5经微晶纤维素诱导后产生了一个酸性β-1,4-葡聚糖酶(BglG5)。纯化的BglG5在pH4.5-5.0和55-60℃条什下酶活最高,甚至在pH1.5-2.0还有很高的降解大麦葡聚糖的活力,且在pH2.0-9.0和55℃以下温度非常稳定,具有很好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力,在模拟胃液条件下稳定。该酶降解的主要产物是葡萄糖和纤维二糖,可以降低饲料和麦芽汁的粘度,以及提高麦芽汁的过滤速率。基于质谱分析获得部分内肽设计简并引物,采用5'-TAIL-PCR和3'-RACE的方法获得BglG5的全长编码基因。BglG5属糖苷水解酶第7家族,其推测氨基酸序列与已知蛋白序列一致性为69%。 与瓶霉G5相比,菌株P13具有较强的产半纤维素酶能力。本研究通过基因克隆得到一个第5家族的甘露聚糖酶基因man5AP13和一个第11家族的木聚糖酶基因xyl11A。它们与已知蛋白序列的最高一致性分别为53%和81%。经酵母表达纯化的重组酶MAN5AP13最适pH为1.5,最适温度为60℃,在pH1.0-7.0范围内可以保持70%以上酶活,55℃处理2h还剩余83%酶活,在模拟胃液中可以降解甘露聚糖,并对其嗜酸和酸性条件下稳定的机理进行了分析。重组酶XYL11A最适pH5.0-5.5,最适温度65℃。 本文从瓶霉属的两个菌株出发,从瓶霉中获得七个具有一定新颖性的纤维素酶和半纤维素酶,包括耐热的纤维素酶,极端嗜酸的甘露聚糖酶,纯化的酸性β-1,4-葡聚糖酶和广谱的葡萄糖苷酶。在获得新颖基因的同时也尝试了原酶纯化及表达,并为嗜酸、嗜热和酶稳定性机理的研究提供了良好的实验材料。瓶霉G5经适当诱变后可直接用于纤维素酶的生产,从而实现快速,有效,低廉地生物能源的生产。