烟草亚硝酸盐还原酶基因nii2的克隆及其功能分析

【摘要】：亚硝酸还原酶(Nitrite Reductase, NiR)是一种可减少亚硝酸盐含量的酶,而亚硝酸盐是烟草特有亚硝胺(tobacco-specific nitrosamines, TSNA)的前体之一。烟草特有亚硝胺是潜在的致癌物质,只存在于烟草及烟草制品中。在硝酸盐代谢途径中,铁氧还蛋白-NiR催化亚硝酸盐还原成铵,因此调控NiR基因的表达会影响硝酸盐同化途径中亚硝酸盐的积累。迄今为止,多种高等植物的NiR cDNA已被克隆,但NiR基因的表达调控在不同的物种中不尽相同。本研究中,我们以烟草为材料,克隆了编码铁氧还蛋白-NiR nii2基因,并构建了植物表达载体pBI121-Ntnii2,以确定在烟草中过量表达该基因是否降低TSNA。此外,我们分析了转基因烟草和野生型烟草的Ntnii2基因表达情况,并检测了硝酸还原酶(Nitrate Reductase, NR)和NiR的活性,以及它们烟草外部过量的硝酸盐和烟草内部亚硝酸盐的反应。主要结果如下 1、克隆Ntnii2基因并构建植物表达载体：根据野生型烟草同源基因的信息,从烟草基因组中克隆Ntnii2基因,此基因全长1764bp,编码一条587个氨基酸的多肽。将Ntnii2连接到pBI121载体,构建植物表达载体pBI121-Ntnii2。 2、转基因植物的获得及分子鉴定：利用农杆菌介导法转化烟草,通过卡那霉素抗性筛选,得到23棵转基因烟草。利用RT-PCR检测,确定NtNii2基因能够被成功转录,并且且获得16株T1代种子,挑选其中8株做进一步的研究。RT-PCR结果表明转基因株系NiR基因的表达水平显著高于野生型。 3、转基因植物的生理特性分析：体内和体外NR活性研究中,选定的8株转基因株系的这两种酶活性均显著高于对应的野生型,在一些转基因株系中增加了约30%的活性。当硝酸盐含量减少近46%时,亚硝酸盐的含量在转化株和非转化株中差别不是十分明显。根据硝酸盐、亚硝酸盐和TSNA的研究,我们得出结论,转Ntnii2基因能够影响烟草的TSNA水平。