小菜蛾和甜菜夜蛾鱼尼丁受体基因克隆及分子药理学研究

【摘要】：自氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺成功创制以来，作用于昆虫鱼尼丁受体（RyR）的化合物合成以及昆虫鱼尼丁受体基因克隆成为研究热点。两种杀虫剂对鳞翅目昆虫均具有较好的活性，然而具体的作用位点尚未明确。本文以小菜蛾幼虫和甜菜夜蛾脂肪体细胞为研究对象，利用RT-PCR克隆两种昆虫的RyR基因。并利用荧光定量PCR首次研究了二酰胺类杀虫剂对小菜蛾和甜菜夜蛾脂肪体细胞鱼尼丁受体基因表达量的差异。结论如下： 1）本研究克隆了小菜蛾鱼尼丁受体（Px-RyR）基因cDNA全长，为15748bp，开放阅读框为15372bp，预测其可以编码5123个氨基酸，分子量为579.5kDa，等电点为5.45。通过对氨基酸二级结构分析，小菜蛾鱼尼丁受体基因，在C-末端存在6个跨膜区域，且存在一个成孔区域GVRAGGGIGD，在小菜蛾鱼尼丁受体基因的N-端存在RyR结构域，此序列出现四次重复，平均相似性为33%。小菜蛾RyR氨基酸序列与烟芽夜蛾和家蚕的相似性均为92%，与果蝇的相似性为78%，与脊椎动物鼠RyR1、RyR2、RyR3的相似性分别为45%、47%、46%。 采用实时荧光定量PCR研究发现鱼尼丁、氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺处理均使敏感小菜蛾3龄幼虫鱼尼丁受体表达量增大。且对氯虫苯甲酰胺产生16.8倍抗性的小菜蛾体内鱼尼丁受体mRNA表达量是敏感小菜蛾的5.79倍。而对照药剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和溴虫腈对小菜蛾幼虫鱼尼丁受体表达量均无影响。 2）本研究也克隆了甜菜夜蛾脂肪体细胞鱼尼丁受体基因cDNA开放阅读框，为15357bp，预测其可以编码5118个氨基酸，分子量为578.7kDa，等电点为5.44。其余特性与小菜蛾均相似。 本研究表明氯虫苯甲酰胺可以使甜菜夜蛾脂肪体细胞RyR表达量上调。随着氯虫苯甲酰胺浓度(0.1nM,1nM,10nM,1M,100M)的增大，在处理后24h Se-RyR表达量是逐渐增大的。而48h时连续处理，随着氯虫苯甲酰胺浓度的增大Se-RyR表达量也呈现逐渐增大的趋势。但是统计分析显示，在处理24h时，氯虫苯甲酰胺浓度对数于Se-RyR表达量呈线性正相关。 综上所述，本研究通过对小菜蛾和甜菜夜蛾RyR基因的克隆以及二酰胺类杀虫剂对敏感小菜蛾和甜菜夜蛾脂肪体细胞RyR mRNA表达量影响的分析。本研究结论为进一步证明二酰胺类化合物的作用机制，并为作用于RyR靶标的新化合物的筛选以及对二酰胺类杀虫剂可能的抗性机制的研究奠定基础。