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小鼠卵巢颗粒细胞BMP-8a和BMP-8b的表达分析及绵羊BMPR-IB基因RNA干扰载体的构建

王建起  
【摘要】:本实验的目的是要研究小鼠卵巢颗粒细胞BMP-8a和BMP-8b的表达情况,为更深入了解卵泡发育过程积累资料;构建绵羊BMPR-IB基因RNA干扰载体,为后续研究绵羊卵巢颗粒细胞BMPR-IB的表达与多胎性状的关系奠定基础。实验共包括以下两部分: 第一部分:小鼠卵巢颗粒细胞BMP-8a和BMP-8b的表达分析。6只21-23日龄雌性ICR小白鼠,皮下注射10IU PMSG,48小时后,刺破卵泡获得颗粒细胞,置入10%FBS的DMEM/F12中培养,青霉素/链霉素浓度为100IU/ml,培养条件为37℃,5%CO2。细胞培养5天后收集细胞,用Trizol提取总RNA,进行RT-PCR验证,切取目的片段胶回收纯化测序。PCR结果和测序结果表明小鼠颗粒细胞可表达BMP-8a transcript variant2和BMP-8b。 第二部分:构建绵羊BMPR-IB基因RNA干扰载体。根据绵羊BMPR-IB的mRNA序列(登录号:NM_001009431),用Dharmacon siDESIGN软件设计成siRNA,选用8个不同分值梯度的siRNA,将siRNA设计成正义链和反义链shRNA。8组正义链和反义链shRNA退火后与经EcoRI和BamHI双酶切的PLVX-shRNA2在T4连接酶体系下重组,连接后转化入DH5α感受态细胞,LB固体培养基培养,挑选阳性菌落,LB液体培养基扩大培养,提取质粒。质粒经EcoRI和BamHI双酶切、HindⅢ酶切和测序3种方法验证载体重组成功,获得了8个绵羊BMPR-IB基因RNA干扰载体。


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